２０２１ 年 １０ 月 Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０２１ Ｖｏｌ．３９ Ｎｏ．１０ １０７７ ～ １０８５ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ 庆贺张玉奎院士八十华诞专辑（ Ⅱ） ·专论与综述 ＤＯＩ： １０．３７２４ ／ ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０２１．０６０２８ 色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中的应用进展 白 玉１，２ ， 范玉凡３ ， 葛广波３∗ ， 王方军２∗
（１． 中国医科大学药学院， 辽宁 沈阳 １１０１２２； ２． 中国科学院大连化学物理研究所， 中国科学院分离 分析化学重点实验室， 辽宁 大连 １１６０２３； ３． 上海中医药大学交叉科学研究院， 上海 ２０１２０３）
摘要：小分子药物进入人体血液循环系统后与人血清白蛋白（ ＨＳＡ） 、α１ ⁃酸性糖蛋白（ ＡＧＰ） 等血浆蛋白存在广泛的 相互作用，这些相互作用深刻影响药物在体内的分布及其与靶标蛋白的结合，进而影响药物效应的发挥。 深入探 究药物与血浆蛋白间的相互作用对于候选药物的成药性优化、新药研发、联合用药的风险评控等意义重大。 而发 展高效、灵敏、准确的分析检测方法是开展药物⁃血浆蛋白相互作用研究的关键。 近年来，色谱技术由于其高通量、 高分离性能、高灵敏度等特点在该领域得到了广泛的应用，包括测定血浆蛋白翻译后修饰对药物结合的影响，多种 药物的竞争性结合等。 其中，高效亲和色谱（ ＨＰＡＣ） 和毛细管电泳（ ＣＥ） 应用最为广泛，能够通过多种分析方法获 取结合常数、结合位点数、解离速率常数等相互作用信息。 该文着重综述了 ＨＰＡＣ 和 ＣＥ 在药物⁃血浆蛋白相互作 用研究中的常用策略及最新研究进展，包括 ＨＰＡＣ 中常用的前沿色谱法、竞争洗脱法、超快亲和提取法、峰值分析 法和峰衰减分析法，以及 ＣＥ 中常用的亲和毛细管电泳法（ ＡＣＥ） 和毛细管电泳前沿分析法（ ＣＥ⁃ＦＡ） 等。 最后，该 文还对当前色谱方法存在的不足进行了总结，并对色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究领域的应用前景和发 展方向进行了展望。 关键词：药物⁃血浆蛋白相互作用；高效亲和色谱；毛细管电泳；综述 中图分类号：Ｏ６５８
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ＢＡＩ Ｙｕ１，２ ， ＦＡＮ Ｙｕｆａｎ３ ， ＧＥ Ｇｕａｎｇｂｏ３∗ ， ＷＡＮＧ Ｆａｎｇｊｕｎ２∗
（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１２２， Ｃｈｉｎａ； ２． ＣＡＳ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｄａｌｉａｎ １１６０２３， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２０３， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｆｔｅｒ ｅｎｔｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ｓｍａｌｌ⁃ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇｓ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ α １ ⁃ａｃｉｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｅｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｆｏｕｎｄｌｙ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｔａｒ⁃ ｇｅｔｓ， ｔｈｕｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ． Ｉｎ⁃ｄｅｐｔｈ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃ⁃
ｔｉｏｎｓ ｉｓ ｏｆ ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｄｒｕｇｓ， ｒｉｓｋ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ， ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｉｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃ⁃
ｔｉｏｎｓ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ｈｉｇｈ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｈｉｇｈ⁃ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ ＨＰＡＣ） ａｎｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ ＣＥ） ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ∗收稿日期：２０２１⁃０６⁃１５
∗通讯联系人．Ｔｅｌ：（０４１１）８２４６４１５０，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｎｇｆｊ＠ ｄｉｃｐ．ａｃ．ｃｎ（ 王方军） ；Ｔｅｌ：（０２１）５１３２３１８４，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｇｅｇｕａｎｇｂｏ＠ ｓｈｕｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ （ 葛广波） ． 基金项目：国家自然科学基金面上项目（９１８５３１０１） ；大连市科技创新基金项目（２０１９Ｊ１１ＣＹ０１９） ．
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｉｔｅｍ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ （ Ｎｏ． ９１８５３１０１） ； Ｄａｌｉａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ Ｎｏ． ２０１９Ｊ１１ＣＹ０１９） ． · １０７８· 色 谱 第 ３９ 卷 ｉｎ ｔｈｉｓ ｆｉｅｌｄ． Ｔｈｅｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｖａｒｉｏｕｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｃｏｎｓｔａｎｔ， ｂｉｎｄｉｎｇ⁃ｓｉｔｅ ｎｕｍｂｅｒ， ａｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ， ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＨＰＡＣ ａｎｄ ＣＥ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ
ａｒｅ ｂｒｉｅｆｌｙ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｔｈｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｒｏｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｚｏｎａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ， ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｐｅａｋ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ， ａｎｄ ｐｅａｋ ｄｅｃａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｆｏｒ ＨＰＡＣ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ ＡＣＥ） ａｎｄ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃ⁃ ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｒｏｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ （ ＣＥ⁃ＦＡ） ｆｏｒ ＣＥ． ＨＰＡＣ ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒ⁃
ｆａｃｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅｓ ｂｙ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ
ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｏｎｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ａｒｅ ｐａｓｓｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＨＰＡＣ ｃｏｌｕｍｎ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｔｉｍｅｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ
ｃａｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｒｕｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ． Ｔｈｅ ｚｏｎａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｓｉｔｅ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｒｕｇｓ
ａｎｄ ｐｒｏｂｅｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｚｏｎａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｅ ｍｕｃｈ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｆｒｏｎｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｉｎｊｅｃｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ｓｅｒｕｍ， ｉｎｔｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｄｒｕｇ ｃｏｍ⁃
ｐｏｎｅｎｔｓ． Ｉｔ ｃａｎ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ． Ｐｅａｋ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｅａｋ ｄｅｃａｙ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｒｅ ｂｏｔｈ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｉｎ ＣＥ ａｎａｌｙｓｉｓ， ｔｈｅ ｄｒｕｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ ａｒｅ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ
ｍｅａｓｕｒｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｌｏｗ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｗａｌｌ ｃａｎ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ ＣＥ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｃｏｍｍｏｎ ＣＥ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｒｅ ＡＣＥ ａｎｄ ＣＥ⁃ＦＡ． ＡＣＥ ｉｓ ｕｓｕａｌｌｙ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｖｉａ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ， ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｒｅｃｅｎｔｌｙ． ＣＥ⁃ＦＡ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｄｒｕｇ ｐｒｅｍｉｘｅｄ ａｔ ａ ｋｎｏｗｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｔａｒ⁃
ｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＣＥ ｍｅｔｈｏｄｓ， ＣＥ⁃ＦＡ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｏｎｌｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｈｉｇｈ⁃ｏｒｄｅｒ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｆｉｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓ ｏｆ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ； ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ ＨＰＡＣ） ； ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ ＣＥ） ； ｒｅｖｉｅｗ 大多数药物吸收入血后都会与血浆蛋白发生不 同程度的可逆性结合，这种非共价相互作用主要包 括静 电 作 用、 氢 键 作 用、 疏 水 相 互 作 用、 范 德 华 力 等 ［１］ 。 人 血 清 白 蛋 白 （ ＨＳＡ ） 和 α １ ⁃酸 性 糖 蛋 白
引用本文：白玉，范玉凡，葛广波，王方军． 色谱技术在药物⁃血浆蛋白相． 色谱，２０２１，３９（１０） ：１０７７－１０８５．
ＢＡＩ Ｙｕ， ＦＡＮ Ｙｕｆａｎ， ＧＥ Ｇｕａｎｇｂｏ， ＷＡＮＧ Ｆａｎｇｊｕｎ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｒｕｇ⁃ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２０２１，３９（１０） ：１０７７－１０８５． 第 １０ 期 白 玉，等：色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中的应用进展
· １０７９· （ ＡＧＰ） 都是血浆中重要的药物结合蛋白 ［２－４］ 。 ＨＳＡ 药效学（ ＰＤ） 与药动学（ ＰＫ） 特性，对于药效发挥快 成，包含 ３ 个同源结构域（ Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ） ；各同源结构 影响 ［１９－２１］ 。 另一方面，当血浆蛋白在外周循环中与 是血浆中丰度最高的蛋白，由 ５８５ 个氨基酸残基组 域又细分为两个子结构域（ Ａ 和 Ｂ） ，各子结构域分 慢、效价强度、血浆半衰期及代谢清除等过程有重要 多种药物结合时，一种药物可能被另一种高浓度 ／ 强
别由 ４ 和 ６ 个 α⁃螺旋组成 ［５，６］ 。 子结构域 Ａ 和 Ｂ 通 结合药物所取代，使其游离型浓度增加，药理作用或 空腔，使 ＨＳＡ 表现出极强的药物结合能力，能与酸 磺胺类药物可在血浆蛋白结合部位竞争性置换出降 过脯氨酸残基提供的柔性环相对移动形成多个疏水 不良反应增强，最终引发药⁃药相互作用 ［３］ 。 例如， 性、碱性和中性药物结合，进一步影响药物的转运、 血糖药甲苯磺丁脲，使后者游离型骤增，从而诱发低
两个主要药物结合位点（ Ｓｕｄｌｏｗ 位点Ⅰ和Ⅱ） 分别 接竞争，但也可能源于一种药物通过变构效应改变 代谢、解毒和失活等过程 ［７，８］ 。 ＨＳＡ 中已被鉴定的 血糖 ［２２］ 。 药物⁃药物置换通常为特定结合位点的直 位于子结构域ⅡＡ 和ⅢＡ（ 见图 １ ［９］ ） ，具有不同的 其他药物的结合 ［１６］ 。 综上所述，针对药物⁃血浆蛋 向结合较大的杂环化合物和二羧酸，如华法林、吲哚 监测及新药研发等都具有重要意义。
大，对芳香族化合物具有较高亲和力，如布洛芬、安 了极 大 发 展， 主 要 包 括： 液 相 色 谱 （ ＬＣ） ［２３］ 、 超 滤 配体结合亲和力 ［１０，１１］ 。 其中，位点Ⅰ空腔较大，倾 美辛、水 杨 酸 等 ［１２－１４］ 。 位 点 Ⅱ 空 腔 狭 小 且 刚 性 较 定等 ［１５］ 。 其他 ＨＳＡ 药物位点还包括它莫西芬位点 和洋地 黄 毒 苷 位 点 等 ［１６］ 。 ＡＧＰ 占 血 浆 总 蛋 白 的
１％ ～ ３％ ，能够与多种中性和碱性药物结合，具有可 饱和与可置换的药物结合特性 ［２］ 。 药物与血浆蛋白的结合与解离通常处于动态平 衡中，蛋白结合型药物作为血液中药物的一种暂时 储存形式，无法实现跨膜转运。 只有游离的药物分 白相互作用的研究，对于个性化精准用药、治疗药物 近年来，药物⁃蛋白相互作用分析检测方法得到
（ ＵＦ） ［２４］ 、平衡透析（ ＥＤ） ［２５］ 、质谱 （ ＭＳ） ［２６］ 、荧光 光谱（ ＦＳ） ［２７］ 、圆二色谱（ ＣＤ） ［２８］ 、表面等离子体共 振（ ＳＰＲ） ［２９］ 、核磁共振 （ ＮＭＲ） ［３０］ 、等温滴定量热 （ＩＴＣ） ［３１］ 、计算机模拟 ［３２］ 等。 色谱方法具有分离效 率高、应用范围广、易于自动化、能与多种检测器兼 容等优点，在药物⁃蛋白相互作用研究中发挥着重要 作用。 用于表征药物⁃蛋白相互作用的色谱技术主
子才能通过被动扩散或各种转运蛋白跨膜运输，到 要 有 高 效 亲 和 色 谱 （ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ 因此，药物血浆蛋白结合率的高低，能够显著影响其 ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＣＥ） 。 本文主要针对这两种技术 达酶或受体等特定药物靶点，发挥药理活性 ［１７，１８］ 。 ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＰＡＣ） 和毛细管电泳 （ ｃａｐｉｌｌａｒｙ 的原理、最新进展和应用进行了综述。
１ 高效亲和色谱法 ＨＰＡＣ 是测定弱到中等强度药物⁃蛋白动态相 互作用的有效方法。 在 ＨＰＡＣ 中，蛋白通常被固载 在色谱固定相表面，进样到色谱流动相中的药物分 子与固定相上的蛋白发生相互作用，通过检测药物 分子保留时间、洗脱轮廓或峰面积等获取药物⁃蛋白 相互作用信息，包括结合常数、结合位点的数量和位 置、解离速率常数等 ［３３，３４］ 。 １．１ 图１ ＨＳＡ 结构及主要药物结合位点（ 以 ＨＳＡ⁃肉豆蔻酸
复合物的晶体结构为例，ＰＤＢ ＩＤ： １Ｅ７Ｇ） ［９］ Ｆｉｇ． １ Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ （ ＨＳＡ） ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｄｒｕｇ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ （ ｔａｋｅ ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＳＡ⁃ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓ ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ， ＰＤＢ ＩＤ： １Ｅ７Ｇ） ＦＡ： ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ．
［９］ ＨＰＡＣ 蛋白固定化方法 制备固载目标蛋白的色谱固定相是 ＨＰＡＣ 的 首要步骤，固定相载体和蛋白固定化方法对所固载 亲和蛋白的活性具有重要影响 ［３５］ 。 二氧化硅由于 具有较高的机械强度、热稳定性和化学稳定性，并且 粒径分布均匀，是目前广泛应用的 ＨＰＡＣ 固定相载 体 ［３３，３６，３７］ 。 共价偶联是蛋白固载的常用策略，利用 表面修饰氨基、环氧基、醛基、羟基、羧酸等功能基团 · １０８０·
色 的固相载体，与目标蛋白上特定氨基酸残基侧链形 成共价连接 。 Ｚｈａｎｇ 等 将刀豆蛋白 Ａ 和橙黄 网胞盘菌凝集素通过还原胺化法固定在二氧化硅 ［３８］ ［３９］ 上，开发了一种凝集素亲和微柱，用于分离和分析 ＡＧＰ 的糖型组分。 Ｌｉａｎｇ 等 利用卤代烷烃脱卤 酶和氯代烷烃之间的生物正交反应，将 Ｈａｌｏｔａｇ 标 ［４０］ 记的血管紧张素Ⅱ１ 型受体共价固定到 ６⁃氯己酸衍 生物修饰的氨基聚苯乙烯微球上，测定了 ４ 种药物
与受体的相互作用。 Ｌｉ 等 ［４１］ 将 β ２ ⁃肾上腺素能受体 （β ２ ⁃ＡＲ） 共价固定在 Ｎ，Ｎ ⁃羰基二咪唑活化的聚苯 乙烯氨基微球上，比二氧化硅固定相具有更高的生 物相容性。 共价偶联方法存在多位点连接、蛋白固 载取向不均一、蛋白活性降低等问题 ［４２，４３］ 。 包埋法 也是一种常用的蛋白固载策略，利用轻度氧化糖原 作为封盖剂，通过它与肼活化载体结合将蛋白包埋 于载体中，可保持蛋白质在载体中的可溶性和高活
性 ［４３，４４］ 。 Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ 等 ［４４］ 开发了一种免疫提取 ／ 包 埋系统，从血清样本中捕获 ＨＳＡ，通过包埋法制备 亲和色谱柱，用于 ＨＳＡ 与多种磺酰脲类药物结合的 研究。 １．２ １．２．１ ＨＰＡＣ 常用分析方法 前沿色谱法 前沿色谱法是一种常用的亲和色谱技术，可用 第 ３９ 卷 谱 变 ［１３，４６］ 。 当药物分子与固载蛋白为单一位点结合时，亲 和柱 饱 和 吸 附 量 ｍ Ｌ， ａｐｐ 与 药 物 浓 度 ［ Ａ］ 的 关 系 为 ［４７］ ：
１ ｍ Ｌ， ａｐｐ ＝ １ １ ＋ Ｋ ａ ｍ Ｌ ［ Ａ］ ｍ Ｌ （１） 其中 Ｋ ａ 为结合平衡常数，ｍ Ｌ 为蛋白柱包含的结合 位点总数。 当亲和蛋白中存在多种类型结合位点时，吸附 谱图将表现出与线性响应的负偏差，需要采用非线 性结合模型和方程进行数据拟合 ［４８］ 。 前沿色谱法 已被应用于 ＨＳＡ 糖化对磺酰脲类药物格列齐特、格 列本 脲、 格 列 吡 嗪、 氯 丙 胺 等 结 合 影 响 机 制 的 研
究 ［４，３３，４９，５０］ ；以及手性药物与蛋白的相互作用研究， 例如普萘诺尔与低密度脂蛋白（ ＬＤＬ） 的立体选择性 结合、甲磺酸伊马替尼与牛血清白蛋白（ ＢＳＡ） 的结 合 ［５１，５２］ 等。 Ｈｅ 等 ［１３］ 在前沿色谱的基础上发展了多步前沿 色谱法，通过采用一系列由低到高浓度的药物溶液 形成多个吸附阶梯平台，测得了 ＨＳＡ 和 ＡＧＰ 与模 型药物的结合常数。 与常规前沿色谱法相比，该方 法只需要在最后进行亲和色谱柱冲洗，简化了改变
于测定色谱柱容量、药物⁃蛋白的结合位点数量、各 药物浓度所产生的多次冲洗和平衡过程，也减少了 色谱法基本分析流程为：将药物溶解于流动相中，以 法（ ＣＭＣ） 结合也被用于研究药物与膜受体相互作 位点的平衡常数以及整体结合强度等 ［１３，４５］ 。 前沿 固定流速通过固载目标蛋白的亲和柱，随着亲和固 定相的吸附饱和，药物流出浓度逐渐增加，最终形成 突破曲线（ 见图 ２） ；改变药物浓度，突破时间随之改
样品消耗量。 此外，多步前沿色谱法与细胞膜色谱 用的平衡解离常数 ［５３，５４］ 。 Ｌｉ 等 ［４１］ 发展了一种前沿 亲和色谱⁃质谱（ ＦＡＣ⁃ＭＳ） 与吸附能分布计算结合 的方法，用于分析 β ２ ⁃ＡＲ⁃药物相互作用。 该方法先 采用 ＦＡＣ⁃ＭＳ 测定沙丁胺醇、特布他林和伪麻黄碱 在 β ２ ⁃ＡＲ 上的原始吸附数据；再利用吸附能分布计 算优化选择了 ３ 种药物与 β ２ ⁃ＡＲ 结合的最佳吸附 模式，分析准确度和精密度显著提高。 ２０１９ 年，Ｓｕｎ
等 ［５５］ 将前沿亲和色谱与吸附能分布计算结合，并用 于研究华法林、Ｌ⁃色氨酸和麻黄碱在固载 ＢＳＡ 表面 的非均相吸附。 １．２．２ 竞争置换洗脱法 竞争洗脱法可用于测定药物在目标蛋白上特定 位点的结合 ［５６］ 。 该方法将药物溶解于流动相中，并 图 ２ ＨＰＡＣ 前沿色谱法进行药物⁃蛋白相互作用研究的示意图 Ｆｉｇ． ２ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｒｏｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅｒ⁃ ｆｏｒｍａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ ＨＰＡＣ）
进样一定量的特异性位点探针，如果药物和探针在 固载蛋白上存在相同结合位点，探针的保留时间将 随所添加药物浓度的改变而变化，由此获得药物在 特定位点的相互作用信息（ 见图 ３） ［１２，５６］ 。 第 １０ 期 白 玉，等：色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中的应用进展 · １０８１· 特异性结合位点，随后进样一定量的 ５⁃氨基水杨酸 盐，根据不同 ＦＡ 浓度时保留时间的变化确定 ＦＡ 和 ５⁃氨基水杨酸盐在 ＨＳＡ 上存在同一结合位点的竞 争 ［６２］ 。 ２０２１ 年，Ｏｖｂｕｄｅ 等 ［３７］ 利用高性能亲和微柱
和竞争洗脱法确定了降糖药瑞格列奈和那格列奈与 ＨＳＡ 特异性位点结合情况；同时测定了 ＨＳＡ 被乙 二醛或甲基乙二醛修饰后药物在 Ｓｕｄｌｏｗ 位点Ⅰ和 Ⅱ的结合变化。 前沿分析法需要向色谱柱中连续输入样品，与
竞争洗脱法相比通常需要更大的样品用量以及更长 的分析时间。 但是前沿色谱分析中各结合位点结合 常数测定之间没有相互干扰，具有更高的精确度，且 图 ３ ＨＰＡＣ 竞争洗脱法进行药物⁃蛋白相互作用研究的示意图 Ｆｉｇ． ３ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｄｒｕｇ⁃ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｚｏｎａｌ ｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＨＰＡＣ 特异性位点探针的保留因子（ ｋ） 计算公式为： ｔ Ｒ －ｔ ０ ｋ＝ （２） ｔ０
其中 ｔ Ｒ 为探针保留时间，ｔ ０ 为死时间。 ｋ 和流动相 中药物浓度［ Ｉ］ 的关系如下 ［５７，５８］ ： ＫＩ Ｖｍ Ｖｍ １ ＝ ［ Ｉ］ ＋ ｋ ＫＡ ｍＬ ＫＡ ｍＬ （３） 其中 ｍ Ｌ 为探针与药物在固定配体上共同结合位点 的物质的量，Ｖ ｍ 为柱的空隙体积，Ｋ Ａ 和 Ｋ Ｉ 分别是 能够同时确定亲和蛋白中结合位点数目和各个位点 的结合常数信息 ［４６，４７，６０］ 。 在设计实验时，一般先采
用前沿色谱分析法测定药物与蛋白质的整体结合强 度，再通过特异性竞争置换洗脱确定特定位点的相 互作用信息，如直接竞争、正或负变构效应、无竞争 等 ［３３］ 。 １．２．３ 超快亲和提取法 超快亲和提取是一种检测药物游离组分的色谱 方法，可直接在溶液体系中检测药物和蛋白的结合 情况 ［６３，６４］ 。 该方法将含有药物 ／ 蛋白混合物的样品 上样到含有固载目标蛋白的亲和微柱上 ［６４］ 。 当流 速足够高时，药物⁃蛋白复合物和可溶性蛋白被洗脱
探针和药物在同一竞争位点的结合常数。 当探针与 为非保留峰，此时可以测定原始样品中游离药物组 过斜率和截距的比值得出药物在该位点的结合常数 流过色谱柱时，一些与可溶性蛋白结合的药物会从 药物为单位点竞争时，１ ／ ｋ 与［ Ｉ］ 为线性关系，可通 分并计算结合常数 ［６５］ 。 当采用低至中等流速，样品 （ 即 Ｋ Ｉ ） ；如果存在多位点结合或其他相互作用，则 中解离，增加游离药物浓度，此时可测定两者的解离
白的整体亲和力 ［１２，５７］ 。 和萃取和双柱系统的方法也被用于测定血清等复杂 会与预测线性关系存在偏差，这时可测得药物和蛋 速率常数 ［６６］ 。 近几年，除单柱体系外，结合超快亲 竞争洗脱法已被用于检测特异性位点探针（ 华 样品中药物的游离组分，估算药物与蛋白的整体亲 和糖化 ＨＳＡ 的结合差异 ［５９］ ；以及研究药物和蛋白 和提取技术，分别采用单柱和双柱系统测定了几种 法林和 Ｌ⁃色氨酸） 和各种磺酰脲类药物与正常 ＨＳＡ
相互作用的影响因素，包括温度、ｐＨ 值、离子强度、 和常数 ［２０，６７－６９］ 。 ２０１８ 年，Ｙａｎｇ 等 ［７０］ 优化了超快亲 磺酰脲类药物与正常及糖化 ＨＳＡ 的整体亲和常数 流动 相 的 组 成 含 量 等 ［５６，６０］ 。 ２０１８ 年， Ｌｉｕ 等 ［６１］ 将 β ２ ⁃ＡＲ 和电压依赖性阴离子通道蛋白 １（ ＶＤＡＣ⁃１） 和解离速率常数，并对两种系统的优势和局限性进 提取化合物中鉴定出红景天苷可同时结合 β ２ ⁃ＡＲ
作更简单，需要的蛋白质量更少，精密度更高，且可 ２０２０ 年，Ｊｅｌｉｃ̌ｉｃ 等 １．２．４ 共固载于亲和色谱柱，利用竞争洗脱策略从红景天 和 ＶＤＡＣ⁃１，并分别确定了其结合位点和结合常数。 ＇ ［６２］ 通过竞争 洗 脱 法 研 究 了 叶 酸 （ ＦＡ） 和 ４ 种 ５⁃氨基水杨酸类药物美沙拉嗪、巴柳 氮、柳氮磺胺吡啶和奥沙拉嗪对 ＨＳＡ 相同位点的竞 争结合情况。 他们首先采用不同浓度 ＦＡ 饱和 ＨＳＡ
行了比较；结果表明双柱系统可以使用更小的游离 药物组分和临床相关药物 ／ 蛋白浓度，但单柱系统操 用于估计药物⁃蛋白相互作用的解离速率常数。 峰值分析法 峰值分析法通常是以单流速或多流速注入药 物，在线性洗脱条件下，测定对照柱和亲和柱上药物 的保留时间和峰值方差（ 即谱带展宽） ，以此计算药 · １０８２· 色 物和固载蛋白的解离速率常数 ［６０，６５，７１，７２］ 。 该方法已 被用于确定 ＨＳＡ 与 Ｌ⁃色氨酸、卡马西平、丙咪嗪等
亲和毛细管电泳法 在 ＡＣＥ 法中，采用含有不同浓度蛋白的缓冲液 作为背景电解质（ ＢＧＥ） 充满毛细管柱，再将药物进 通过峰值分析法测定了 ５ 种药物沙 衡， 药 物 的 电 泳 迁 移 率 在 与 蛋 白 结 合 后 发 生 改 ［７３，７４］ 因的两种手性代谢物与 ＨＳＡ 的解离情况 ［７１］ 。 ２０１８ 年，Ｌｉａｎｇ 等 ２．１ 第 ３９ 卷 ；也被用于同时测定苯妥 配体的解离速率常数 ［７５］
谱 样到毛细管内，在管内建立药物⁃蛋白结合动态平 丁胺醇、特布他林、甲氧苯胺、盐酸异丙肾上腺素和 变 ［９３，９４］ 。 实验中常加入电渗流（ ＥＯＦ） 标记物对药 方法被用于测定阿齐沙坦、坎地沙坦、缬沙坦和奥美 度改变所产生的影响 ［９５］ 。 药物的有效迁移率取决 １．２．５ 用研究方面应用广泛，已被用于表征 ４ 种儿茶素与 盐酸麻黄碱与 β ２ ⁃ＡＲ 的解离速率常数。 ２０２０ 年，该 沙坦与血管紧张素 ＩＩ 型受体的解离速率常数 ［４０］ 。 峰衰减分析法
峰衰减分析法首先采用含有药物的样品溶液使 固载目标蛋白的亲和色谱柱达到饱和吸附，随后采 用空白流动相进行洗脱，随时间推移检测药物的释 放情况，产生一阶衰减曲线，可根据斜率测得药物的 解离速率常数 ［４７，６０，７６］ 。 为了防止药物释放后与亲和
物的迁移率进行校准，抵消不同蛋白浓度下 ＢＧＥ 黏 于 ＢＧＥ 中的蛋白浓度。 ＡＣＥ 在药物⁃蛋白相互作 ＨＳＡ 和 ＢＳＡ 的 结 合 ［９６］ ， 评 估 ＨＳＡ 的 翻 译 后 修 饰 （ Ｎ⁃和 Ｓ⁃同型半胱氨酸化） 对 ＨＳＡ 与儿茶素相互作 用的影响并测定结合常数等 ［９７］ 。 此外， ＡＣＥ 也被 用于手 性 药 物 与 蛋 白 的 结 合 研 究， 通 常 以 ＨＳＡ、 ＡＧＰ 等作为固载蛋白，在实现药物对映体基线分离
固定相重新结合，峰衰减分析法通常使用短微柱、高 的同时，测定对映体与蛋白的结合常数 ［１，９８］ 。 方法相比，非竞争性的峰衰减分析法不需要测定塔 与凝血酶的结合常数，进一步利用分子对接模拟确 流速 ［７７，７８］ 。 与其他测量解离速率常数的亲和色谱 板高度 具 ［１７］ ［７９］ ，是高通量分析药物⁃蛋白解离的有效工 。 ２０１８ 年，Ａｎｇｕｉｚｏｌａ 等 ［８０］ 通过峰衰减分析法 研究了流速和洗脱 ｐＨ 值对几种免疫球蛋白 Ｇ 从亲 和微柱中解离的影响。
２ ＣＥ 作为一种高效、高灵敏的分离检测技术，可 以在接近生理的条件下进行，不需要高度纯化的样 品，不需要固载和标记相互作用的组分，在药物⁃蛋 白相互作用研究中极具吸引力 ［８１－８４］ 。 ＣＥ 的缺点是 样品中的蛋白容易吸附于毛细管壁上，稳定性较低， 在分析之前需要采用 ＮａＯＨ、ＨＣｌ 或十二烷基硫酸 钠（ ＳＤＳ） 溶液清洗内壁 ［８５，８６］ 。 用于药物⁃蛋白相互作用研究的 ＣＥ 方法主要
包括亲和毛细管电泳（ ＡＣＥ） ［８７］ 和毛细管电泳⁃前沿 Ｄｒｅｙｅｒ法（ ＨＤ） ［８８］ ［８９］ ， 其 他 方 法 还 包 括 Ｈｕｍｍｅｌ 、空位峰法 （ ＶＰ） ［９０］ 和空位亲和 毛细管电泳法（ ＶＡＣＥ） ［９１］ 等。 在这些方法中，ＣＥ⁃ ＦＡ、ＨＤ、ＶＰ 等方法需要采用外标或内标进行校准， 而 ＡＣＥ 和 ＶＡＣＥ 法中结合参数根据药物的有效迁
移 率 进 行 测 定 ［９２］ 。 Ｍｉｃｈａｌｃｏｖá 等 ［８５］ 采 用 ＡＣＥ、 ＣＥ⁃ＦＡ、ＨＤ 法对 ＢＳＡ 和水杨酸的相互作用进行了 研究，结果表明最佳的电泳分析方法为 ＣＥ⁃ＦＡ，它 具有通量高、自动化程度高、消耗样品量少、分析时 间短等优点。
定结合位点，解析了化合物与酶活性中心的相互作 用机制。 Šｏｌíｎｏｖá 等 ［１００］ 发展了部分填充亲和毛细 管电泳法（ ＰＦ⁃ＡＣＥ） ，测定了人胰岛素六聚体与血 清素、多巴胺、精氨酸和苯酚的结合常数。 ＰＦ⁃ＡＣＥ 的优点是避免蛋白溶液随药物进入检测器，克服蛋 毛细管电泳 分 析 （ ＣＥ⁃ＦＡ ） Ｌｉ 等 ［９９］ 通过 ＡＣＥ 法测定了 １０ 种酚类化合物 白溶液产生的高背景信号干扰 ［１０１］ 。 ＣＥ 过程中蛋
白结构和活性的稳定性一直是一个挑战。 近年来， 离子液体双水相体系（ ＩＬＡＴＰＳ） 结合了双水相体系 （ ＡＴＰＳｓ） 和短链亲水性离子液体 （ ＩＬｓ） 的优点，可 以增强 ＡＣＥ 中蛋白质的稳定性，从而提高 ＡＣＥ 方 法的测量精度 ［１０２－１０４］ 。 ２０１８ 年，Ｅｌ⁃Ｈａｄｙ 等 ［９５］ 采用 亲水咪唑 ＩＬＡＴＰＳ 作为运行缓冲液，提高了 ＡＣＥ 分 析过程中 ＡＧＰ 蛋白的稳定性，精确测定了 ＡＧＰ 与 普萘洛尔、甲氨蝶呤、和长春碱的结合常数。
２．２ 毛细管电泳前沿分析法 ＣＥ⁃ＦＡ 具有操作简便、分析时间短，能够分析 高亲和体系和多重平衡等优点 ［８３，１０５］ 。 ＣＥ⁃ＦＡ 用于 研究药物⁃蛋白相互作用时，需要游离药物和药物⁃ 蛋白复合物具有不同的电泳迁移率，且游离蛋白和 药物⁃蛋白复合物的迁移率相近 ［１０６］ 。 在 ＣＥ⁃ＦＡ 分 析中，将已知浓度的药物和目标蛋白预先混合，随后 进样到充满缓冲溶液的毛细管柱中，在电泳过程中 将产生一个方形峰，根据峰高可获得游离药物浓度 （需绘 制 无 蛋 白 时 的 药 物 浓 度 与 峰 高 的 校 准 曲 线） ［１０７，１０８］ 。 由于平台峰的高度很少受到药物迁移
第 １０ 期 白 玉，等：色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中的应用进展 · １０８３· 时间、电渗流（ ＥＯＦ） 、毛细管长度和施加电压的影 然是未来研究的重点。 近年来，随着各种色谱分析 白上的 结 合 位 点 数 （ ｎ） 和 结 合 常 数 （ Ｋ ｂ ） 计 算 公 谱⁃质谱联用等分析仪器的进步，为药物⁃血浆蛋白 响，ＣＥ⁃ＦＡ 方法的稳定性较好 式 ［１０９，１１０］ 为： ｒ＝ ［ Ｄ ｂｏｕｎｄ ］ ［ Ｐ ｔｏｔａｌ ］
ｍ ＝ ∑ ｎｉ ｉ＝１ ［１０８］ 。 药物在目标蛋 Ｋ ｂｉ ［ Ｄ ｆｒｅｅ ］ １ ＋Ｋ ｂｉ ［ Ｄ ｆｒｅｅ ］ （４） 其中 ｒ 为结合药物浓度和总蛋白浓度之比，［ Ｄ ｂｏｕｎｄ ］ 和［ Ｄ ｆｒｅｅ ］ 分别代表结合药物浓度和游离药物浓度， ［ Ｐ ｔｏｔａｌ ］ 为总蛋白浓度，ｍ 为蛋白上各种类型药物结 合位点的总数，ｎ ｉ 为蛋白质上等效结合位点的最大 数目，Ｋ ｂｉ 为相关结合常数。
ＣＥ⁃ＦＡ 法已被用于评估正常 ＨＳＡ 和糖化 ＨＳＡ 与第一代磺酰脲类降糖药之间的亲和力 ［８３］ ，以及检 测常用抗凝剂华法林与 ＨＳＡ 和 ＢＳＡ 的高阶相互作 用等研究中 ［１１１］ 。 为了减少蛋白在毛细管内壁的吸 附，Ｄｕ 等 ［１１２］ 将星形共聚物聚乙烯亚胺⁃接枝⁃聚（ ２⁃
甲 基⁃２⁃恶 唑 啉 ） （ ＰＥＩ⁃ｇ⁃ＰＭＯＸＡ ） 与 聚 多 巴 胺 （ＰＤＡ） 共沉积于熔融石英毛细管内壁，制备了一种 ＰＥＩ⁃ｇ⁃ＰＭＯＸＡ ／ ＰＤＡ 包覆的抗蛋白吸附毛细管，通 过 ＣＥ⁃ＦＡ 研究了对乙酰氨基酚与 ＢＳＡ 的相 互 作 用，比常规毛细管具有更好的分析准确度，与荧光光
方法与技术的推陈出新和不断完善，以及高性能色 相互作用研究提供了更多的选择和多种技术组合， 有望进一步提高分析的准确性并提供更多维度的药 物⁃蛋白相互作用信息。 参考文献： ［１］ ［２］ ［３］ ［４］ ［５］ ［６］ ［７］ ［８］ ［９］ 利 用 ＣＥ⁃ＦＡ 法 ［１０］ 研究了双氯芬酸、布洛芬、氯丙胺和托尔布他米对 ［１１］ 谱法结果相当。 Ｎｅｖíｄａｌｏｖá 等 ［１１３］ ＨＳＡ 与 Ｌ⁃色氨酸和利多卡因结合的影响，并测定了 这些药物与 ＨＳＡ 的结合常数。 Ｍｉｃｈａｌｃｏｖá 等 ［１１４］
基于层流廓线的横向扩散（ ＴＤＬＦＰ） 和电泳介导微 分析（ ＥＭＭＡ） 的原理发展了药物和蛋白混合样品 在线 ＣＥ⁃ＦＡ 法，样品混合、孵化、分离的过程全部实 现自动化，测定了 ＢＳＡ 与普萘诺尔、利多卡因和酸 性药物苯丁他松的结合参数，显著增加了分析通量， ［１２］ ［１３］ ［１４］ ［１５］ 减少了试剂的消耗及人工操作引起的实验误差。 ［１６］ ３ ［１７］ 小结 本文所述的各种色谱方法与技术不仅可以用于
药物⁃血浆蛋白相互作用研究，对于蛋白⁃蛋白、蛋白⁃ 核酸、蛋白⁃多糖等生物分子相互作用也具有普适 性。 而色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中 的局限性主要包括：ＨＰＡＣ 法需要将目标蛋白固载 于色谱固定相，可能改变蛋白的构象及其药物结合 ［１８］ ［１９］ ［２０］ ［２１］ ［２２］ 性质 ［１１５］ ；在 ＣＥ 过程中存在蛋白在毛细管壁上的非 ［２３］ 题，发展更简单、高效的色谱分析方法，进一步提高
［２４］ 特异性吸附、蛋白稳定性下降等情况。 针对这些问 药物⁃蛋白相互作用分析的灵敏度、准确度和通量仍 ［２５］ Ｘｕ Ｙ， Ｈｏｎｇ Ｔ， Ｃｈｅｎ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１７， ３８（９ ／ １０） ： １３６６ ＡｌＡｊｍｉ Ｍ Ｆ， Ｒｅｈｍａｎ Ｍ Ｔ， Ｋｈａｎ Ｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ Ａｃｔａ Ａ Ｍｏｌ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ， ２０２０， ２２５： １１７４５７
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Ｅｓｍａｅｉｌｚａｄｅｈ Ｓ， Ｖａｌｉｚａｄｅｈ Ｈ， Ｚａｋｅｒｉ⁃Ｍｉｌａｎｉ Ｐ． Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１７， ２２（８） ： ９８２ Ｗａｔｅｒｓ Ｎ Ｊ， Ｊｏｎｅｓ Ｒ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ， ２００８，
· １０８４· ［２６］ ［２７］ ［２８］ ［２９］ ［３０］ ［３１］ ［３２］ ［３３］ ［３４］ ［３５］ ［３６］ ［３７］ ［３８］ ［３９］ ［４０］ ［４１］ ［４２］ ［４３］ ［４４］ ［４５］ ［４６］ ［４７］ ［４８］ ［４９］ ［５０］ ［５１］ ［５２］ ［５３］ ［５４］ ［５５］ 色 ９７（１０） ： ４５８６ Ｗａｎｇ Ｂ， Ｑｉｎ Ｑ， Ｃｈａｎｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，
２０１８， ４１０（３） ： ８２７ Ｚｈａｏ Ｐ， Ｇａｏ Ｇ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， 谱 ［５６］ ［５７］ ２０１７， １４１： ２６２ ［５８］ ２０１９， ２０（１１） ： ２７２７ ［５９］ ｔｒｙ， ２０２０， ５９（１４） ： １４１０ ［６０］
Ｒａｈｍａｎ Ｓ， Ｒｅｈｍａｎ Ｍ Ｔ， Ｒａｂｂａｎｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｅ， Ｎｉｅｌｓｅｎ Ａ Ｄ， Ｄｅｍｕｔｈ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ⁃ Ｗｕ Ｄ， Ｙａｎ Ｊ， Ｓｕｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１６， １２９： １５ ［６１］ Ｂｅｉｇｏｌｉ Ｓ， Ｓｈａｒｉｆｉ Ｒａｄ Ａ， Ａｓｋａｒｉ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ
［６２］ Ｒｉｆａｉｏｇｌｕ Ａ Ｓ， Ａｔａｓ Ｈ， Ｍａｒｔｉｎ Ｍ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ， ［６３］ Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， Ｌｉ Ｚ， Ｚｈｅｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ［６４］ Ｚｈｕ Ｍ， Ｃｕｉ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１９， １５８６： ［６５］ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｅ Ｌ， Ｐｏｄｄａｒ Ｓ， Ｉｆｔｅｋｈａｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ
［６６］ Ｌｉｕ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｐ， Ｌｉ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ， ２０１７， ３０（７） ： ［６７］ Ｏｖｂｕｄｅ Ｓ Ｔ， Ｔａｏ Ｐ， Ｌｉ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ［６８］ ｄｅ Ｍｏｒａｅｓ Ｍ Ｃ， Ｃａｒｄｏｓｏ Ｃ Ｌ， Ｃａｓｓ Ｑ Ｂ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ， ［６９］ Ｚｈａｎｇ Ｃ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ， ２０１９， １０７８： １８９
［７０］ １６２０： ４６１００３ ［７１］ Ｄｙｎ， ２０１９， ３７（９） ： ２２６５ ２０１９， ２０（５） ： １８７８ ２０１５， ４０７（１８） ： ５３０９ ８２ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０２０， １１５７： １２２３３２ ２６１３ ２０２１， ２０１： １１４０９７ ２０１９， ７： ７５２
Ｌｉａｎｇ Ｑ， Ｆｕ Ｘ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０２０， Ｌｉ Ｑ， Ｎｉｎｇ Ｘ， Ａｎ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１８， ９０（１３） ： ７９０３ Ａｎｇｕｉｚｏｌａ Ｊ， Ｂｉ Ｃ， Ｋｏｋｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ［７２］ ２０１６， ４０８（２１） ： ５７４５ ［７３］ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０１９， １１２１： １
［７４］ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０２０， １１３６： １２１８１２ ［７５］ １２９７６１ ［７６］
Ｖａｒｇａｓ⁃Ｂａｄｉｌｌａ Ｊ， Ｐｏｄｄａｒ Ｓ， Ａｚａｒｉａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｅ Ｌ， Ｐｏｄｄａｒ Ｓ， Ｃｈｏｋｓｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｋａｓａｉ Ｋ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｇｅｎ Ｓｕｂｊ， ２０２１， １８６５（ １） ： Ｌｉ Ｚ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１７， １４４： １２
Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ， Ｊａｃｋｓｏｎ Ａ， Ｓｏｂａｎｓｋｙ Ｍ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ［７７］ ２００９， ３２（５ ／ ６） ： ８３５ ［７８］ ９６８： ４９ ［７９］ Ａ， ２０１２， １２６５： １１４ ［８０］ Ｃｈｅｍ， ２０１１， ４０１（９） ： ２８１１ ［８１］ （３） ： ８０５ ［８２］ （２） ： ５６３ ［８４］
Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｌｉ Ｚ， Ｂｅｅｒａｍ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ， ２０１４， Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， Ａｎｇｕｉｚｏｌａ Ｊ， Ｊｏｓｅｐｈ Ｋ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， Ａｎｇｕｉｚｏｌａ Ｊ， Ｊｏｓｅｐｈ Ｋ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｍａ Ｌ， Ｌｉ Ｊ， Ｚｈａｏ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１６， ４０８ Ｓｏｂａｎｓｋｙ Ｍ Ｒ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１２， ４０３ Ｈｅ Ｘ， Ｓｕｉ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉ⁃ ｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０２０， １１６１： １２２４３６
Ｗｅｉ Ｆ， Ｈｅ Ｘ， Ｘｕ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０２０， １１６１： １２２４４３ Ｓｕｎ Ｈ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｌｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ ［８３］ ［８５］ ［８６］ ［８７］ 第 ３９ 卷 Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０１９， １１２５： １２１７２７
Ｔａｏ Ｐ， Ｐｏｄｄａｒ Ｓ， Ｓｕｎ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１８， １４６： ３ Ｌｉ Ｑ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｚｈｅｎｇ Ｙ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１５， １４０１： ７５ Ｎｏｃｔｏｒ Ｔ Ａ， Ｗａｉｎｅｒ Ｉ Ｗ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ， １９９２， ５７７（２） ： ３０５ Ｊａｃｋｓｏｎ Ａ Ｊ， Ａｎｇｕｉｚｏｌａ Ｊ， Ｐｆａｕｎｍｉｌｌｅｒ Ｅ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏ⁃ ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１３， ４０５（１７） ： ５８３３
Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， ２０１７， ６３（６） ： １０８３ Ｌｉｕ Ｔ， Ｈｏｕ Ｙ， Ｌｉｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０１８， １１００ ／ １１０１： ７６ Ｊｅｌｉｃｉｃ Ｍ Ｌ， Ｂｒｕｓａｃ Ｅ， Ｋｌａｒｉｃ Ｄ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ， ２０２０， １０ （１） ： ２０８３８
Ｂｅｅｒａｍ Ｓ Ｒ， Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｓｕｈ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１８， １４６： ４６ Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｌｉ Ｚ， Ｐｏｄａｒｉｕ Ｍ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１４， ８６ （１３） ： ６４５４ Ｂｅｅｒａｍ Ｓ， Ｂｉ Ｃ， Ｚｈｅｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１７， １４９７： ９２ Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｂｉ Ｃ， Ｂｒｏｏｋｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１５， ８７ （２２） ： １１１８７
Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｐｏｄａｒｉｕ Ｍ， Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１６， ４０８（１） ： １３１ Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｙｏｏ Ｍ Ｊ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ａｎａｌｙｓｔ， ２０１３， １３８ （ ２１ ） ： ６２６２ Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｍａｔｓｕｄａ Ｒ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１４， １３７１： ８２ Ｙａｎｇ Ｂ， Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈ⁃ ｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ２０１８， １１０２ ／ １１０３： ８
Ｔｏｎｇ Ｚ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１１， １２１８（３９） ： ６８９２ Ｉｆｔｅｋｈａｒ Ｓ， Ｏｖｂｕｄｅ Ｓ Ｔ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ， ２０１９， ７： ６７３ Ｔｏｎｇ Ｚ， Ｓｃｈｉｅｌ Ｊ Ｅ， Ｐａｐａｓｔａｖｒｏｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１１， １２１８（１５） ： ２０６５ Ｓｃｈｉｅｌ Ｊ Ｅ， Ｍ． Ｏ Ｃ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００９， ８１（１１） ：
４３２０ Ｌｉａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｆｅｉ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１８， １５３８： １７ Ｍｏｏｒｅ Ｒ Ｍ， Ｗａｌｔｅｒｓ Ｒ Ｒ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， １９８７， ３８４： ９１ Ｂｉ Ｃ， Ｂｅｅｒａｍ Ｓ， Ｌｉ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１５， １７： １６ Ｚｈｅｎｇ Ｘ， Ｂｉ Ｃ， Ｌｉ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１５，
１１３： １６３ Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｓｃｈｉｅｌ Ｊ Ｅ， Ｈａｇｅ Ｄ Ｓ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ２００９， ３２ （ １０） ： １６３２ Ａｎｇｕｉｚｏｌａ Ｊ Ａ， Ｐｆａｕｎｍｉｌｌｅｒ Ｅ Ｌ， Ｍｉｌａｎｕｋ Ｍ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈ⁃ ｏｄｓ， ２０１８， １４６： ３９ Ｅｌ⁃Ｈａｄｙ Ｄ， Ｋｕｈｎｅ Ｓ， Ｅｌ⁃Ｍａａｌｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１０， ５２（２） ： ２３２
Ｇａｏ Ｚ， Ｚｈｏｎｇ Ｗ． Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０２１， Ｍｉｃｈａｌｃｏｖá Ｌ， Ｇｌａｔｚ Ｚ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ２０１６， ３９（１８） ： ３６３１ Ｑｉａｎ Ｃ， Ｋｏｖａｌｃｈｉｋ Ｋ Ａ， ＭａｃＬｅｎｎａｎ Ｍ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏ⁃ ｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１７， ３８（１２） ： １５７２ Ｍｉｃｈａｌｃｏｖａ Ｌ， Ｇｌａｔｚ Ｚ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ２０１５， ３８（２） ： ３２５
Ｎｅｖｉｄａｌｏｖａ Ｈ， Ｍｉｃｈａｌｃｏｖａ Ｌ， Ｇｌａｔｚ Ｚ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１８， ３９（４） ： ５８１ Ｚｈａｎｇ Ｌ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｋ， Ｚｈａｎｇ Ｘ Ｘ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ， ２００７， 第 １０ 期 ［８８］ ［８９］ ［９０］ ［９１］ ［９２］ ［９３］ ［９４］ ［９５］ ［９６］ ［９７］ ［９８］ ［９９］ ［１００］ 白 玉，等：色谱技术在药物⁃血浆蛋白相互作用研究中的应用进展
６０３（１） ： １０１ ［１０１］ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００８， ３９１（２） ： ６２５ ［１０２］ ２００５， ２８（２） ： １２１ ［１０３］ （１８） ： ３２１４ ［１０４］ （１６） ： ３３３３ ［１０６］
Ｄｉｎｉｚ Ａ， Ｅｓｃｕｄｅｒ⁃Ｇｉｌａｂｅｒｔ Ｌ， Ｌｏｐｅｓ Ｎ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｒｕｄｎｅｖ Ａ Ｖ， Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ Ｓ Ｓ， Ｓｅｍｅｎｏｖａ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， Ｆａｎｇ Ｎ， Ｓｕｎ Ｙ， Ｚｈｅｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２００７， ２８ Ｓｕｎ Ｙ， Ｆａｎｇ Ｎ， Ｃｈｅｎ Ｄ Ｄ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２００８， ２９ Ｄｖｏｒａｋ Ｍ， Ｓｖｏｂｏｄｏｖａ Ｊ， Ｂｅｎｅｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，
２０１３， ３４（５） ： ７６１ Ｗａｎｇ Ｙ， Ａｄｅｏｙｅ Ｄ Ｉ， Ｏｇｕｎｋｕｎｌｅ Ｅ Ｏ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０２１， ９３（１） ： ２９５ Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｓｈａ Ｙ， Ｑｉａｎ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１７， ３８ ［１０５］ ［１０７］ ［１０８］ ［１０９］ （７） ： １０３８ ［１１０］ Ｚｉｎｅｌｌｕ Ａ， Ｓｏｔｇｉａ Ｓ， Ｓｃａｎｕ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０１４，
［１１１］ Ｚｉｎｅｌｌｕ Ａ， Ｓｏｔｇｉａ Ｓ， Ｓｃａｎｕ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｔｒ， ２０１７， ５６ ［１１２］ Ａｂｄ Ｅｌ⁃Ｈａｄｙ Ｄ， Ａｌｂｉｓｈｒｉ Ｈ Ｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１８， １４６： １２０ １３６７： １６７ （２） ： ７８５ Ｒａｔｉｈ Ｒ， Ｗａｔｚｉｇ Ｈ， Ｓｔｅｉｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ２０２０， ４３ ［１１３］
（２０） ： ３９６０ ［１１４］ ２０１８， ２０１８： ４７０７６０９ ［１１５］
Ｌｉ Ｑ Ｑ， Ｙａｎｇ Ｙ Ｘ， Ｑｖ Ｊ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｈｅｍ， Ｓｏｌｉｎｏｖａ Ｖ， Ｚａｋｏｖａ Ｌ， Ｊｉｒａｃｅｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ， ２０１９， １０５２： １７０ · １０８５· Ｃｈｕ Ｂ⁃Ｌ， Ｌｉｎ Ｊ⁃Ｍ， Ｗａｎｇ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２００９， ３０（１６） ： ２８４５
Ｅｌ⁃Ｈａｄｙ Ｄ Ａ， Ａｌｂｉｓｈｒｉ Ｈ Ｍ， Ｒｅｎｇａｒａｊａｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏ⁃ ｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１５， ３６（２４） ： ３０８０ Ｅｌ⁃Ｈａｄｙ Ｄ Ａ， Ａｌｂｉｓｈｒｉ Ｈ Ｍ， Ｗäｔｚｉｇ Ｈ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１６， ３７（１２） ： １６０９ ＭｃＱｕｅｅｎ Ｌ， Ｌａｉ Ｄ． Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ， ２０１９， ７： １３５
Ｑｉａｎ Ｃ， Ｗａｎｇ Ｓ， Ｆｕ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２０１８， Ｒａｆｏｌｓ Ｃ， Ｚａｒｚａ Ｓ， Ｂｏｓｃｈ Ｅ． Ｔａｌａｎｔａ， ２０１４， １３０： ２４１ Ｌｕ Ｑ⁃ｈ， Ｂａ Ｃ⁃ｄ， Ｃｈｅｎ Ｄ⁃ｙ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２００８， ４７（４ ／ ５） ： ８８８ Ｚｈａｏ Ｌ， Ｃｈｅｎ Ｄ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ， ２０１５， ２９（１） ： １２３
Ｌｉｕ Ｔ Ｔ， Ｘｉａｎｇ Ｌ Ｌ， Ｗａｎｇ Ｊ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１５， １１５： ３１ Øｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｊ， Ｓｃｈｏｕ Ｃ， Ｌａｒｓｅｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ２００２， ２３（１７） ： ２８４２ Ｒａｆｏｌｓ Ｃ， Ａｍｅｚｑｕｅｔａ Ｓ， Ｆｕｇｕｅｔ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１８， １５０： ４５２
Ｄｕ Ｈ， Ｚｈａｎｇ Ｃ， Ｍａｏ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｌａｎｔａ， ２０１７， １７０： ２７５ Ｎｅｖｉｄａｌｏｖａ Ｈ， Ｍｉｃｈａｌｃｏｖａ Ｌ， Ｇｌａｔｚ Ｚ． Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ， ２０２０， ４３ （２２） ： ４２２５ Ｍｉｃｈａｌｃｏｖａ Ｌ， Ｎｅｖｉｄａｌｏｖａ Ｈ， Ｇｌａｔｚ Ｚ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ２０２１， １６３５： ４６１７３４ Ｖｕｉｇｎｉｅｒ Ｋ， Ｓｃｈａｐｐｌｅｒ Ｊ， Ｖｅｕｔｈｅｙ Ｊ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉ⁃ ｏｍｅｄ Ａｎａｌ， ２０１０， ５３（５） ： １２８８