第43 卷第2 期 2025 年3 月 食品科学技术学报 Journal of Food Science and Technology
Vol. 43 No. 2 Mar. 2025 doi:10. 12301 / spxb202400823
文章编号:2095鄄6002(2025)02鄄0019鄄10 引用格式:秦慧民,岳世强,叶伟江,等. D鄄阿洛酮糖的高效生物催化合成研究进展[J]. 食品科学技术学报,2025,43(2):19 -28.
QIN Huimin, YUE Shiqiang, YE Weijiang, et al. Research progress on efficient biocatalytic synthesis of D鄄allulose[J].
Journal of Food Science and Technology, 2025,43(2):19 - 28.
D鄄阿洛酮糖的高效生物催化合成研究进展 秦慧民 1,摇岳世强 1,摇叶伟江 2,摇王楷喆 1,摇高宇昂
1 (1. 天津科技大学生物工程学院/ 工业发酵微生物教育部重点实验室, 天津摇300457; 2. 山东省科技馆, 山东济南摇250000)
摘摇要: D鄄阿洛酮糖是一种新型的具有降血糖、抗氧化等特殊生理功能的低热量稀有糖。目前, D鄄阿洛酮糖的生物合成主要是利用D鄄阿洛酮糖3鄄差向异构酶来催化D鄄果糖生成D鄄阿洛酮糖,利
用生物酶法大规模合成D鄄阿洛酮糖的研究重点主要集中在提升差向异构酶的催化活性、热稳定性 和耐酸性以满足工业生产的需求。介绍了D鄄阿洛酮糖的生产现状及其生物酶法合成的最新进展,
包括异构酶的分子定向改造、辅助定向进化的超高通量筛选方法、新型酶分子的固定化策略等以提 升差向异构酶的工业属性,并进一步探讨了全细胞催化系统在D鄄阿洛酮糖生产中的应用。研究旨
在为D鄄阿洛酮糖的高效生物催化合成提供理论参考,并提出工业生产中存在的挑战和潜在的解决 方案。 关键词: D鄄阿洛酮糖; D鄄阿洛酮糖3鄄差向异构酶; 高通量筛选策略; 固定化技术; 全细胞催化
中图分类号: TS201郾2; TS245郾9 摇摇摇摇摇文献标志码: A 收稿日期: 2024 12
30 基金项目: 天津科技大学大学生创新创业训练计划项目(202410057166)。 Foundation: Tianjin University of Science and Technology College Students Innovation and Entrepreneurship
Training Program Project (202410057166).
第一作者: 秦慧民,男,教授,博士,主要从事酶工程方面的研究。 摇摇随着生活水平的不断提高,我国居民的膳食
结构发生了显著变化,高糖、高脂肪食物的过度摄 入导致肥胖症、糖尿病、高血压和高血脂等慢性疾 病的患病率不断攀升。国际糖尿病联盟( IDF)
2021 年数据显示, 中国糖尿病患者数量达1郾4 亿[1] ,位居全球首位。从“ 十二五冶规划到“ 十四
五冶规划,国家持续出台新政策支持符合健康需求 的代糖产品的发展。在这一背景下,D鄄阿洛酮糖 因甜度高、溶解度高、低热量以及较低的血糖反
应[2 - 3] ,同时具备抗肥胖[4] 、清除活性氧[5] 等生理 功能,受到了广泛关注。此外,2002 年美国食品药
品监督管理局(FDA)已批准D鄄阿洛酮糖应用于膳 食补充剂及食品配料中[6] 。然而,D鄄阿洛酮糖在
自然界中含量极少,仅存在于少数植物[7] 和特定 细菌[8] 中,难以用自然提取的方法大量生产。此 外,化学合成法也存在选择性不高、反应条件苛
刻、污染环境等诸多弊端[9 - 11] 。相比之下,生物酶 法合成D鄄阿洛酮糖具有反应条件温和、分离纯化
简便、副产物少等优势。当前,如何绿色高效地生 产D鄄阿洛酮糖一直是研究的热点问题。基于此, 本研究通过分析生物酶法合成D鄄阿洛酮糖的最新
进展,重点讨论如何改造关键酶D鄄阿洛酮糖3鄄差 向异构酶(DAEase)催化性能提升途径及固定化酶 在D鄄阿洛酮糖生产中的应用,同时探讨利用多种
微生物表达系统实现全细胞生产D鄄阿洛酮糖的方 法,希望为进一步提高D鄄阿洛酮糖生产效率提供 9 1 参考。
1摇生物酶法合成D鄄阿洛酮糖研究 摇摇高效生物催化合成D鄄阿洛酮糖的策略见图1。 为实现D鄄阿洛酮糖的生物合成,日本香川大学稀少
摇摇摇 糖研究中心(Kagawa University Rare Sugar Research Centre)的Ken Izumori 教授建立了一种新颖的稀少
糖合成策略(Izumoring 策略) [12]。该策略基于可逆 异构化原理,通过醛酮糖异构化、酮糖C鄄3 差向异构
化和单糖氧化还原这3 种酶促反应实现单糖的动态 循环转化和D鄄阿洛酮糖的定向合成[13]。其中,酮 摇摇
图1摇高效合成D鄄阿洛酮糖的策略 Fig. 1摇Strategies for efficient synthesis of D鄄allulose
糖3鄄差向异构酶(KEase) 是Izumoring 策略的关键, 在催化D鄄果糖向D鄄阿洛酮糖的差向异构化反应中
起着不可替代的作用。迄今为止,已从近30 种微生 物中分离鉴定出具有差异特性的KEase(表1),其
中包括Pseudomonas cichorii ST-24 的D鄄塔格糖3鄄差 向异构酶DTEase[14]、Agrobacterium tumefaciens 的
D鄄阿洛酮糖3鄄差向异构酶DAEase[15] 和Mesorhizobi鄄 um loti Tono 来源的L鄄核酮糖3鄄差向异构酶
LREas[16]等。由表1 可知,不同KEase 的最适反应温 度通常为40 ~70 益,在55 益以上的高温下其热稳定
性较差,酶活性急剧下降[17];此外,这些酶在中性或 弱碱性(pH =7郾5 ~9郾0)的催化条件下表现出最适活
性,并且催化活性依赖金属离子。值得注意的是, DAEase 因其广泛的微生物来源(Clostridium、Thermo鄄 gutta 等极端环境菌株)、高底物特异性(对D鄄果糖的
选择性系数> 95% )及可工程化潜力,成为KEase 家 族中研究最为深入的酶类之一。D鄄阿洛酮糖的生物
合成方式见图2。除Izumoring 策略外,一些高效合成 D鄄阿洛酮糖的酶促方法(非Izumoring 策略)也不断涌
现,包括醛缩酶催化的缩合反应[18]、磷酸化-去磷酸 化级联反应[19] 等。这些非Izumoring 酶促法主要通
过磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖的醛缩酶催化生成 D鄄阿洛酮糖,或通过D鄄阿洛酮糖6鄄磷酸3鄄表异构酶 (A6PE)将D鄄果糖6鄄磷酸转化为D鄄阿洛酮糖6鄄磷酸,
图2摇D鄄阿洛酮糖的生物合成方式 Fig. 2摇Biosynthesis synthesis pathway of D鄄allulose
再脱磷酸生成D鄄阿洛酮糖。这些新型酶催化路径的 开发进一步拓展了D鄄阿洛酮糖的合成体系。 0 2 食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇
摇2025 年3 月 表1摇酮糖3鄄差向异构酶的来源和性质 Tab. 1摇Sources and properties of ketose 3鄄epimerase
酶的来源及类型 最适pH 值 最适温度/ 益 金属离子 半衰期/ min (kcat / Km) / (mmol - 1·min - 1)
参考文献 Pseudomonas cichorii ST鄄24(DTEase) 7郾5 60 - - - [14]
Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970(DAEase) 8郾0 50
Mn2 + 63郾5(50 益) 85 [15] Rhodobacter spHaeroides sK011(DFEase)
9郾0 40 Mn2 + 约60(50 益) - [8] Clostridium cellulolyticum H10(DAEase)
8郾0 55 Co2 + 408(60 益) 62郾7 [20] Mesorhizobium loti Tono(LREase)
8郾0 60 Mn2 + 138(70 益) - [16] Clostridium scindens ATCC 35704(DAEase)
7郾5 60 Mn2 + 50(60 益) 64郾5 [21] Dorea sp郾CAG317(DAEase)
6郾0 70 Co2 + ~ 30(60 益) 199 [22] Treponema primitia Zas -1 (DAEase)
8郾0 70 Co2 + ~ 30(50 益) 63 [23] Agrobacterium sp郾ATCC 31749(DAEase)
7郾5 ~ 8郾0 55 ~ 60 Co2 + 267(55 益) 58郾6 [24] StapHylococcus aureus(DAEase)
8郾0 70 Mg2 + 122郾4(70 益) 55郾8 [25] Escherichia coli(DTEase)
6郾0 50 Ni2 + - 45 [26] Rhodopirellula baltica(DAEase)
8郾0 60 Mn2 + 52郾3(60 益) 11郾45 [27] Thermoclostridium caenicola(DAEase)
7郾5 65 Co2 + 816(50 益) 132 [28] Sinorhizobium fredii(DAEase)
7郾5 70 Mg2 + 600(60 益) 55郾8 [29] Caballeronia insecticola(DAEase)
9郾0 65 Mn2 + - 1郾482 [30] Thermogutta terrifontis(DAEase)
8郾0 70 Mg2 + 2 160(70 益) - [31] 摇摇 - 代表数据未报道。 2摇 DAEase 工业属性的迭代优化改良
研究 2郾1摇DAEase 热稳定性的提高 2郾1郾1摇计算机辅助设计提高酶的热稳定性 在D鄄阿洛酮糖的工业化生产中,较高的反应温
度有助于提高反应速度、增加底物溶解度并抑制微 生物污染。然而,大多数天然DAEase 热稳定性较 差[32],当温度超过55 益时,酶活性会迅速下降,这
限制了其在高温条件下的应用。通过理性设计或半 理性设计对关键酶进行改造是提升其热稳定性的重 要手段。如Mao 等[27] 通过对R郾baltica DAEase 进
行定点突变,引入的Phe 增加了该酶局部疏水作用 (L144F),使其热稳定性提升了约2 倍。相比之下,
Zhang 等[33] 在多聚体界面引入氢键( F154Y/ E191D/ I193F),显著增强了酶四级结构的稳定性,
使Tm 提升17郾54 益,半衰期延长5郾4 倍,证实调控 氢键网络能够有效提升系统的热稳定性。值得注意
的是, 催化活性与热稳定性常呈现非线性关联。 Zhu 等[25] 获得的S郾 aureus DAEase 三重突变体
S191D/ M193E / S213C 通过底物结合区优化,实现稳 定性与活性双提升( Tm 提高7郾2 益, 活性提高
68% );而Li 等[34]报道的C郾insecticola DAE 突变体 S37N/ F157Y 在65 益下半衰期延长了17 倍,但催化
活性仅提升14郾7% (图3),这表明过度刚性可能抑 制底物诱导的酶构象变化。 图3摇基于液滴微流控技术的筛选管道及DAEase
活性的高效液相色谱分析 Fig. 3摇Screening pipeline based on droplet microfluidic tech鄄 nology and DAEase activity analysis combined with high performance liquid chromatography
基于蛋白质的结构精准定位关键残基对酶进 行理性设计,实现酶分子热稳定性和催化活性的 协同优化;而半理性设计则利用酶-底物确定潜在
热点残基,并结合定点饱和突变技术,能够在较短 1 2 第43 卷第2 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇秦慧民等: D鄄阿洛酮糖的高效生物催化合成研究进展
时间内筛选出性能优异的突变体。因此,未来仍 需深入解析酶分子的构效关系,同时兼顾酶的动 态功能需求与静态结构稳定性,以进一步提高其
工业应用性能。 2郾1郾2摇高通量筛选技术辅助酶的定向进化 通过易错PCR 构建突变体文库,结合比色法、
生物传感器以及生长耦联等高通量筛选(HTS)方法 可实现对目标酶分子特性的快速优化,具体的高通 量筛选策略见表2。Chen 等[35] 基于D鄄果糖和D鄄阿
洛酮糖在Si (IV) -Mo (VI) 溶液中不同还原能力, 开发非酶促比色法筛选C郾 cellulolyticum 来源的
CcDAEase 突变体[36],获得组合突变体MT4(S38F/ F42N/ A70P/ T119P),其工业属性提升,D鄄阿洛酮糖
产率提高至28郾3% 。然而,比色法的灵敏度和特异 性会受到反应条件的限制。Liu 等[37] 通过将DAE鄄 ase 酶活性与荧光信号相偶联,构建超高通量筛选体
系。发现突变体I228V/ D281G/ C289R 的酶活性达 野生型的1郾42 倍,60 益下的半衰期延长了62郾97
倍。Li 等[34]基于PsiR 的生物传感器,对来自C郾in鄄 secticola 的DAEase 进行定向进化[30],筛选出催化活
性提高14郾7% 、半衰期增加17郾23 倍的DAEase 突 变体S37N/ F157Y。Li 等[ 38 - 39] 进一步整合生物传
感器与微流控技术,基于PsiR 转录因子的荧光偶联 系统结合微液滴平台(筛选效率105 个液滴/ h) 获
得S郾 fredii 突变体M3 - 2 ( S11G/ L42T/ L96M/ 1109E / E152N/ P247G/ F242Y/ A254C),催化活性提
高了17 倍;同时,Li 等[39] 还开发了生长-荧光双信 号耦联的体内筛选平台(GBIO),使得Agrobacterium sp郾
突变体M42 ( P38N/ V102A/ Y201L/ S207N/ I251R)在60 益下的半衰期延长2郾5 倍,且催化活性
提升6郾28 倍。 摇摇高通量筛选平台辅助的定向进化技术通过快速 识别具有优良特性的酶突变体,显著加快了工业级
酶元件的开发进程。但高通量筛选过程中仍存在假 阳性高、精度低等问题,需结合液滴微流控技术进一 步开发特异性强、灵敏度高的生物传感器。
2郾2摇DAEase 的耐酸性提升 天然DAEase 的最适催化pH 值通常集中于中 性至弱碱性范围(7郾5 ~ 9郾0) [40],然而在碱性条件
下,D鄄阿洛酮糖易发生非酶促褐变,生成羟甲基糠醛 (HMF)等副产物,导致产物分离纯化难度和成本显 著增加[41]。然而,酸性环境(pH < 6郾5)可以有效抑
制这种情况的发生,提高DAEase 的酸耐受性成为 优化其工业适用性的关键方向。Hu 等[41] 利用双启
动子表达系统,在枯草芽孢杆菌中协同表达Dorea sp郾CAG:317 和C郾cellulolyticum H10 来源的DAE鄄 ase,使重组菌株Bs168 / pMA5-DSdpe -RCdpe 在pH
值为6郾5 时酶活性较单酶表达体系提升9郾9% ~ 13郾2% 。双启动子共表达策略更适合快速提升酶的
活性和稳定性,尤其是在中性和弱酸性条件下,但其 对极端酸性环境的适应性有限。计算分析与分子改 造则更适合精确调控酶的pH 耐受性,尤其是在极
端酸性条件下表现出显著优势。Li 等[42] 通过分子 动力学模拟发现,DAEase 表面负电荷残基数与其最
表2摇辅助DAEase 定向进化的高通量筛选策略 Tab. 2摇High鄄throughput screening strategies assist in directed evolution of DAEase
方法 原理 DAEase 来源及组合突变体 筛选结果 参考文献 基于D鄄果糖脱氢酶的比 色法 通过果糖脱氢酶测定体系中剩余果糖的
浓度 Agrobacterium tumefaciens (I33L S213C) 半衰期(50 益) 提高
29郾9 倍 [43] 基于转录因子的生物传 感器 生物传感器激活mCherry 的表达,进而 产生荧光信号
Clostridium cellulolyticum (S142N) kcat值提高2郾45 倍 [44]
基于核糖醇脱氢酶的比 色法 通过KpRD 检测NADH 的氧化 Sinorhizobium fredii (M15S / P40N/ S209N)
半衰期(60 益) 提高 2郾2 倍 [29] 基于Si( IV) - Mo( VI) 溶 液的非酶促比色法
利用D鄄果糖和D鄄阿洛酮糖在酸性溶液 中还原力不同产生的颜色差 Clostridium cellulolyticum (S38F/ F42N/ A70P/ T119P)
半衰期(60 益) 提高 11郾4 倍 [35] 基于生物传感器的微液滴 筛选(DMSP) 基于荧光检测的目标酶筛选系统与液滴
微流控平台优秀的单细胞分离及分选能 力相结合 Sinorhizobium fredii(S11G/ L42T/
L96M/ 1109E / E152N/ P247G/ F242Y/ A254C) 催化活性提升17 倍 [38]
基于生物传感器的生长耦 合体内筛选平台(BASP) 控制氯霉素抗性基因的表达将酶的催化 特性与突变体的生长状况相联系
Agrobacterium sp. SUL3(P38N/ V102A/ Y201L/ S207N/ I251R)
催化活性提升6郾28 倍,半衰期(60 益)提 高2郾5 倍 [39] 2 2 食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇
摇2025 年3 月 适pH 值呈负相关性,因此,优化C郾cellulolyticum H10 来源的CcDAEase 电荷分布,获得突变体M3 在 pH 值为5郾0 时活性保留率提升至63% ( 野生型
37% ),极端pH 值为3郾0 下仍保有10% 活性。通过 基因工程技术对DAEase 进行分子改造,可显著提
升该酶对环境的耐受性,使其更适用于D鄄阿洛酮糖的 工业化生产。 2郾3摇固定化技术助力DAEase 催化性能的提升
游离酶因固有的不稳定性限制了其在D鄄阿洛 酮糖生产过程中的应用,固定化技术已成为优化 DAEase 工业催化性能的核心策略。通过将酶与合
适的载体结合可以大幅提升酶的环境耐受性与操作 稳定性[45]。传统固定化方法虽操作简便,但受限于 传质效率与活性位点屏蔽效应,其催化性能难以满
足规模化生产需求[46]。而Takeshita 等[47]通过构建 含有DTEase 的E郾coli JM105 重组菌株,并采用全
细胞固定化策略,D鄄阿洛酮糖转化率提升至25% 。 Lim 等[48]进一步利用硼酸盐修饰的Duolite A568 载
体固定A郾 tumefaciens DAEase, 实现底物浓度 700 g / L 下产率达63% (441 g / L D鄄阿洛酮糖)。此
外,新型载体固定化方法(如改性二氧化钛纳米粒 子[49]、铁氧化物磁性纳米颗粒[50]、氧化石墨烯颗
粒[51])在提高催化效率和稳定性方面表现出显著优 势。然而酶的随机固定可能会导致活性位点无法与 底物有效接触,从而降低酶的催化活性并延长反应
时间。Gao 等[52]利用Spy Catcher/ Spy Tag 系统通过 生物正交化学反应控制酶分子在载体表面的取向进
行DAEase 的定向固定化。DI - CcDAE( 定向固定 化)的kcat / Km值比RI -CcDAE(随机固定化)提高了
2郾4 倍,且在连续7 个循环后仍保持80% 的相对活 性。这揭示定向固定化方法在催化效率和稳定性方
面优于随机固定化方法。为进一步提高酶环境耐受 性,Gao 等[53] 设计自组装蛋白-双金属杂化纳米花
系统(HNFs) 对SfDAE 进行固定化,在极端酸性条 件下(pH 值为2郾0) 孵育6 h 后仍能保持约20% 的
活性,在70 益下其半衰期显著延长4郾3 倍。此外, SfDAE - HNFs 循环使用8 次后活性保持率达
92郾4% ,远超传统载体。 固定化技术可以显著提升酶的热稳定性与操作 寿命,进而提高D鄄阿洛酮糖产量,但其规模化应用
仍面临载体成本高昂、传质阻力大( 孔隙率< 10 nm)等挑战。因此,未来可以开发具有环境响应 特性的智能固定化载体以及可再生生物质的功能化
载体材料,并优化多酶级联固定化策略,以满足D鄄 阿洛酮糖工业化应用的实际需求。 3摇 微生物细胞工厂促进D鄄阿洛酮糖
高效生产研究 摇摇微生物细胞工厂(如大肠杆菌Escherichia coli、 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 及酿酒酵母Saccharo鄄 myces cerevisiae)的内源性辅因子供给与亚细胞区室
化保护作用,为DAEase 提供了稳定的微环境,是D鄄 阿洛酮糖规模化生产的理想模式[54]。基于这一优
势,在构建工程菌株的基础上,进一步定向重构碳代 谢流向,并优化关键酶的转录调控系统,从而显著提 高目标产物的时空产率。这种将代谢网络与表达调
控进行协同优化的策略,充分发挥了微生物细胞工 厂的固有优势,同时为工业级细胞工厂的构建提供 了系统性解决方案。
3郾1摇大肠杆菌中D鄄阿洛酮糖合成途径 大肠杆菌(Escherichia coli) 已被广泛用作表达
不同来源DAEase 的宿主菌株,并采用碳代谢调控、 辅因子再生等策略提升D鄄阿洛酮糖的生产水平。 Zhang 等[55]通过在E郾coli BL21(DE3)中共表达A郾 cellulolyticus 来源的D鄄葡萄糖异构酶( AcGIs) 和来
自Dorea sp郾CAG 的DAEase,D鄄阿洛酮糖转化率为 17郾82% ,但其多酶系统会使菌体存在代谢负担增加
的问题。Park 等[56] 优化A郾tumefaciens DAEase 突 变体( I33L - S213C), 在E郾coli 工程菌株中实现
D鄄阿洛酮糖转化率达到33% 。为进一步突破Izu鄄 moring 策略的热力学平衡限制[21] (D鄄果糖转化率约
30% ),Guo 等[57 - 60]通过系统改造E郾coli 的代谢网 络,敲除fruA、manXYZ 等基因阻断果糖磷酸化副反
应,引入SecY驻P 蛋白通道增强D鄄果糖跨膜转运;并 结合磷酸化- 去磷酸化级联反应(AlsE / A6PP 催化
果糖鄄6鄄磷酸寅阿洛酮糖鄄6鄄磷酸寅D鄄阿洛酮糖),使 转化率提升至0郾72 g / g ( 甘油为碳源时产率
1郾59 g / L)。通过融合PPK1 介导的ATP 再生系统 与酶空间定位优化,分批补料发酵时D鄄阿洛酮糖产
量进一步提升至15郾80 g / L,转化率达84郾8% 。与 传统方法相比,这些策略精准调控了代谢分配与能
量平衡,为D鄄阿洛酮糖的工业化连续发酵提供了一 个高效且经济的解决方案。 3郾2摇枯草芽孢杆菌中D鄄阿洛酮糖合成途径
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 作为一种无内 3 2 第43 卷第2 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇秦慧民等: D鄄阿洛酮糖的高效生物催化合成研究进展
毒素且符合公认安全(GRAS) 标准的菌株,是D鄄阿 洛酮糖全细胞催化的重要宿主。其高效的蛋白系统 可将DAEase 直接释放到胞外,有效简化后续分离
步骤[61]。为了提高D鄄阿洛酮糖的生产效率,胡扬 帆等[62]以B郾subtilis WB800 为底盘菌株,异源表达
C郾insecticola DAEase,并对通过启动子工程( P43、 PHpaII、PylbP等)筛选获得高效表达菌株,4 h 即可实现
30郾06% 转化率(150郾3 g / L D鄄阿洛酮糖)。Zhang 等[63]进一步优化代谢通量,在B郾subtilis WB600 中
构建双启动子(PamyE - PHpaII) 菌株WB -D3P11 表达 S郾fredii DAEase,在5 L 分批补料发酵中D鄄阿洛酮
糖产量达到了74郾2 g / L。通过启动子优化策略提高 酶的表达水平进而提升D鄄阿洛酮糖的产量,共表达
与自诱导启动子工程均能显著提高酶的活性和产 量,可能更适合大规模工业化生产。Hu 等[41] 在 B郾subtilis 168 中共表达了功能互补的DAEase 同工
酶(DSdpe 和RCdpe),并利用自诱导启动子工程优 化表达盒,获得最优工程菌株Bs168/ pMA5-PspoVG - DSdpe -PsrfA-RCdpe,pH 值为6郾5 时的比活性较单
酶菌株提升11 倍, 42 h 发酵酶活峰值达 480郾1 U/ mL。通过表达元件优化、碳代谢流调控
等,显著提升了B郾subtilis 全细胞合成D鄄阿洛酮糖 的产量,为规模化生产D鄄阿洛酮糖提供了更经济的
解决方案。 3郾3摇其他菌株中D鄄阿洛酮糖合成途径 酵母是一种常见的食品级微生物,具有生长迅 速、发酵密度高且对抑制剂和污染物耐受性强的优
点。Xia 等[64]利用GroE 分子伴侣辅助成功在酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae) 中表达了Agrobacterium tumefaciens来源的DAEase。此外,Yang 等[65]还尝试
了马克斯克鲁维酵母( Kluyveromyces marxianus) 作 为DAEase 的异源表达宿主,成功构建了工程化菌
株,实现了D鄄阿洛酮糖的生产。朱星星[66] 利用K郾 marxianus 作为DAEase 的异源表达宿主,通过全细
胞催化在最优条件下,用750 g / L 的D鄄果糖生成了 190 g / L 的D鄄阿洛酮糖。尽管酵母系统在操作上相
对简便且其培养条件较为宽松,但仍存在蛋白表达 水平较低和发酵周期较长等问题。谷氨酸棒状杆菌 Corynebacterium glutamicum 作为一种公认安全 (GRAS)的宿主菌株,在质粒稳定性和表达量方面
表现更优。Park 等[67] 成功地将F郾plautii DAEase 异源表达于C郾glutamicum 中,并通过20 mg / L 青霉
素和体积分数10% 甲苯对重组谷氨酸棒杆菌细胞 进行透化处理。当细胞浓度为10 g / L 时, 仅需
40 min,750 g / L 的D鄄果糖就可转化为235 g / L 的D鄄 阿洛酮糖。Yang 等[68] 通过多位点整合策略,在C郾 glutamicum 染色体稳定表达了11 个DAE 基因拷
贝,重组菌株(C-DAE9)粗酶活性是单个DAE 基因 菌株的16郾4 倍。在分批补料培养条件下,C -DAE9
菌株酶活性高达44 700 U/ L。 采用不同的优化策略(如启动子工程、碳代谢 调控等),对酵母、谷氨酸棒杆菌等食品级菌株进行
改造,已在DAEase 的生产中展现出积极的前景。 随着这些表达系统的不断优化和规模化应用,未来 在食品工业中实现高效生产D鄄阿洛酮糖将变得更
加可行。 4摇总结与展望 D鄄阿洛酮糖作为一种具有特殊生理功能的稀有 糖,在食品和医药行业中具有广阔的应用前景。目
前,D鄄阿洛酮糖的主要生产方式是利用DAEase 对D鄄 果糖进行异构化。为了克服天然DAEase 存在的热稳
定性和耐酸性差等问题,对酶进行分子改造和定向筛 选将更有助于该酶在工业中的应用。本研究综述了 基于计算机算法的DAEase 结构的分子改造、高通量
筛选技术的开发、DAEase 新型固定化策略,以及高效 微生物细胞工厂的最新进展。这些策略为提升DAE鄄 ase 的工业应用性能提供了重要的参考。
在绿色生产D鄄阿洛酮糖的过程中,仍存在一些 亟待解决的问题,主要包括以下几点:1) 关键酶的 性能瓶颈亟待突破。通过计算机辅助目标酶的智能
设计进行分子改造,并基于生物传感器开发操作简 单、灵敏度高且成本低的高通量筛选策略,以对目标 酶的工业属性进行迭代优化和改良。2) 游离酶在
工业生产中的不稳定性和难以回收等问题。开发新 型酶分子固定化策略,如纳米自组装技术,对酶分子 的空间结构进行精准调控,以提高其在极端条件下
的耐受性。3) 食品安全问题。应进一步构建和优 化食品级表达系统,在GRAS 微生物(如枯草芽孢杆 菌和谷氨酸棒状杆菌) 中进行高密度发酵,搭建高
效的微生物细胞工厂。值得注意的是,目前大部分 研究集中在上游工艺,如提高生物转化率或产量,然 而D鄄阿洛酮糖的生产仍面临高成本和下游分离提
取困难的挑战。利用低成本生物质作为原料或优化 分离纯化步骤,是降低生产成本的关键途径。绿色 4 2 食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇
摇2025 年3 月 生产D鄄阿洛酮糖仍面临技术和经济方面的挑战,但 随着酶工程技术以及食品级微生物表达系统的不断
优化,未来实现高效且低成本的D鄄阿洛酮糖生产将 更加切实可行,并为其在食品和医药行业的广泛应 用提供坚实基础。
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Research Progress on Efficient Biocatalytic Synthesis of D鄄Allulose
QIN Huimin1,摇YUE Shiqiang1,摇YE Weijiang2,摇WANG Kaizhe1,摇GAO Yuang1 (1. College of Biotechnology / Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,
Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;
2. Shandong Science and Technology Museum, Jinan 250000, China)
Abstract: D鄄allulose is a novel low鄄calorie rare sugar with special physiological functions, including blood sugar regulation and antioxidant effects. In present, the biological synthesis of D鄄allulose mainly utilized D鄄allulose 3鄄epimerase to catalyze the conversion of D鄄fructose into D鄄allulose. The large鄄scale biosynthesis of D鄄allulose using biological enzymes has primarily focused on improving the catalytic activity, thermal stability, and acid tolerance of D鄄allulose 3鄄epimerase to meet industrial production requirements. The research progress on the current status of D鄄allulose production and the latest advances in its biosynthesis, including molecular鄄directed modification of isomerases, ultra鄄high鄄throughput screening assisted by directed evolution, and novel enzyme immobilization strategies to enhance the industrial properties of D鄄allulose 3鄄epimerase were summarized. Furthermore, the application of whole鄄 cell catalytic systems in D鄄allulose production was also discussed. The aim of this review was to provide a reference for the efficient and green biosynthesis of D鄄allulose and to propose challenges and possible solutions in industrial production.
Keywords: D鄄allulose; D鄄allulose 3鄄epimerase; high鄄throughput screening strategies; immobilization technology; whole鄄cell catalysis (责任编辑:张逸群)
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