Microglial Cytokines Mediate Plasticity Induced by 10 Hz Repetitive Magnetic Stimulation

✅ 全文

小胶质细胞细胞因子介导10 Hz重复磁刺激诱导的可塑性

作者 Amelie Eichler; Dimitrios Kleidonas; Zsolt Turi; Maximilian Fliegauf; M. Kirsch; Dietmar Pfeifer; Takahiro Masuda; Marco Prinz; Maximilian Lenz; Andreas Vlachos 期刊 Journal of Neuroscience 发表日期 2023 ISSN 0270-6474 DOI 10.1523/jneurosci.2226-22.2023 类型原创研究 (Original Research)

📄 英文摘要 English Abstract

Microglia, the resident immune cells of the CNS, sense the activity of neurons and regulate physiological brain functions. They have been implicated in the pathology of brain diseases associated with alterations in neural excitability and plasticity. However, experimental and therapeutic approaches that modulate microglia function in a brain region-specific manner have not been established. In this study, we tested for the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), a clinically used noninvasive brain stimulation technique, on microglia-mediated synaptic plasticity; 10 Hz electromagnetic stimulation triggered a release of plasticity-promoting cytokines from microglia in mouse organotypic brain tissue cultures of both sexes, while no significant changes in microglial morphology or microglia dynamics were observed. Indeed, substitution of tumor necrosis factor α (TNFα) and interleukin 6 (IL6) preserved synaptic plasticity induced by 10 Hz stimulation in the absence of microglia. Consistent with these findings, in vivo depletion of microglia abolished rTMS-induced changes in neurotransmission in the mPFC of anesthetized mice of both sexes. We conclude that rTMS affects neural excitability and plasticity by modulating the release of cytokines from microglia. SIGNIFICANCE STATEMENT Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) is a noninvasive brain stimulation technique that induces cortical plasticity. Despite its wide use in neuroscience and clinical practice (e.g., depression treatment), the cellular and molecular mechanisms of rTMS-mediated plasticity remain not well understood. Herein, we report an important role of microglia and plasticity-promoting cytokines in synaptic plasticity induced by 10 Hz rTMS in organotypic slice cultures and anesthetized mice, thereby identifying microglia-mediated synaptic adaptation as a target of rTMS-based interventions.

📄 中文摘要 Chinese Abstract

中文

重复经颅磁刺激（rTMS）是一种非侵入性脑刺激技术，可诱导皮层可塑性。尽管rTMS在神经科学和临床实践（如抑郁症治疗）中广泛应用，但其介导可塑性的细胞和分子机制仍不甚明了。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，能够感知神经元活动并调节生理性脑功能。研究表明，小胶质细胞参与了与神经兴奋性和可塑性改变相关的脑疾病病理过程。然而，目前尚缺乏能够以脑区特异性方式调节小胶质细胞功能的实验和治疗手段。近期研究表明，小胶质细胞能够感知并调节突触传递和可塑性，而网络活动的改变可调节小胶质细胞状态，表现为小胶质细胞突起的动态伸展和回缩、小胶质细胞与神经元之间物理接触的形成，以及可塑性调节因子的活动依赖性分泌。具体而言，促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）和白介素6（IL-6）的可塑性调节作用已在多项实验中得到证实。

📋 英文结构化总结 English Structured Summary

全文整理

Background:

Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) is a non-invasive brain stimulation technique that induces cortical plasticity. Despite its wide use in neuroscience and clinical practice (e.g., depression treatment) the cellular and molecular mechanisms of rTMS-mediated plasticity remain not well understood. Microglia—the resident immune cells of the central nervous system—sense the activity of neurons and regulate physiological brain functions. They have been implicated in the pathology of brain diseases associated with alterations in neural excitability and plasticity. However, experimental and therapeutic approaches that modulate microglia function in a brain-region-specific manner have not been established. Recent work suggests that microglia sense and regulate synaptic transmission and plasticity, and that changes in network activity modulate microglia states, reflected by dynamic extension and retraction of microglial processes, formation of physical contacts between microglia and neurons, and activity-dependent secretion of plasticity-modulating factors. Specifically, the plasticity-modulating effects of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 6 (IL-6), have been demonstrated in several experimental settings.

Methods:

In this study, 10 Hz electromagnetic stimulation was applied to mouse organotypic brain tissue cultures of both sexes to test for effects on microglia-mediated synaptic plasticity. Additionally, in vivo depletion of microglia was performed in anesthetized mice of both sexes, and changes in neurotransmission in the medial prefrontal cortex (mPFC) were assessed. Substitution of TNFα and IL-6 was used to test whether these cytokines could preserve synaptic plasticity in the absence of microglia.

Results:

10 Hz electromagnetic stimulation triggered a release of plasticity-promoting cytokines from microglia in mouse organotypic brain tissue cultures of both sexes, while no significant changes in microglial morphology or microglia dynamics were observed. Substitution of tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 6 (IL-6) preserved synaptic plasticity induced by 10 Hz stimulation in the absence of microglia. Consistent with these findings, in vivo depletion of microglia abolished rTMS-induced changes in neurotransmission in the medial prefrontal cortex (mPFC) of anesthetized mice of both sexes.

Data Summary:

The provided text does not include specific quantitative results, such as statistical values, effect sizes, or numerical data. The findings are reported qualitatively, describing the release of cytokines, preservation of plasticity upon cytokine substitution, and abolition of changes after microglial depletion. No statistics or numerical summaries are available in the extracted text.

Conclusions:

We conclude that rTMS affects neural excitability and plasticity by modulating the release of cytokines from microglia. This identifies microglia-mediated synaptic adaptation as a target of rTMS-based interventions.

Practical Significance:

rTMS is a clinically employed non-invasive brain stimulation technique used for the treatment of patients with pharmaco-resistant depression. The identification of microglia and plasticity-promoting cytokines as mediators of rTMS-induced plasticity provides a cellular and molecular basis for understanding and potentially optimizing rTMS-based interventions, highlighting microglia-mediated synaptic adaptation as a therapeutic target.

📋 中文结构化总结 Chinese Structured Summary

中文

背景:

方法:

本研究对雌雄小鼠的器官型脑组织培养物施加10 Hz电磁刺激，以检测其对小胶质细胞介导的突触可塑性的影响。此外，在雌雄麻醉小鼠体内进行小胶质细胞耗竭实验，并评估内侧前额叶皮层（mPFC）中神经传递的变化。通过补充TNFα和IL-6，测试这些细胞因子是否能在小胶质细胞缺失的情况下维持突触可塑性。

结果:

10 Hz电磁刺激触发了雌雄小鼠器官型脑组织培养物中小胶质细胞释放可塑性促进性细胞因子，但未观察到小胶质细胞形态或动力学的显著变化。补充肿瘤坏死因子α（TNFα）和白介素6（IL-6）在小胶质细胞缺失的情况下维持了10 Hz刺激诱导的突触可塑性。与上述发现一致，在雌雄麻醉小鼠中，体内耗竭小胶质细胞消除了rTMS诱导的内侧前额叶皮层（mPFC）神经传递变化。

数据摘要:

所提供的文本未包含具体的定量结果，如统计值、效应量或数值数据。研究结果以定性方式报告，描述了细胞因子的释放、细胞因子替代后对可塑性的维持，以及小胶质细胞耗竭后相关变化的消除。提取的文本中无统计数据或数值摘要。

结论:

我们得出结论，rTMS通过调节小胶质细胞释放细胞因子来影响神经兴奋性和可塑性。这确定了小胶质细胞介导的突触适应性是rTMS干预的靶点。

实际意义:

rTMS是一种临床使用的非侵入性脑刺激技术，用于治疗药物难治性抑郁症患者。将小胶质细胞和可塑性促进性细胞因子鉴定为rTMS诱导可塑性的介导因素，为理解和潜在优化rTMS干预提供了细胞和分子基础，突出了小胶质细胞介导的突触适应性作为治疗靶点的重要性。

📖 英文全文 English Full Text

Research Articles: Development/Plasticity/Repair

Microglial Cytokines Mediate Plasticity Induced by 10 Hz Repetitive Magnetic Stimulation https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2226-22.2023 Cite as: J. Neurosci 2023; 10.1523/JNEUROSCI.2226-22.2023 Received: 4 December 2022 Revised: 15 February 2023 Accepted: 10 March 2023

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Copyright © 2023 Eichler et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license, which permits unrestricted use, distribution and reproduction in any medium provided that the original work is properly attributed.

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3URSLGLXP LRGLGH VWDLQLQJ 7LVVXH FXOWXUHV ZHUH LQFXEDWHG ZLWK SURSLGLXP LRGLGH 3, ȝJPO3,QYLWURJHQ IRUKZDVKHGLQSKRVSKDWHEXIIHUHGVDOLQH 3%6 DQGIL[HGDV GHVFULEHG EHORZ &XOWXUHV WUHDWHG IRU K ZLWK 10'$ ȝJPO 7RFULV VHUYHG DV SRVLWLYH FRQWUROV LQ WKHVH H[SHULPHQWV &HOO QXFOHL ZHUH VWDLQHG ZLWK '$3, VHFWLRQV ZHUH PRXQWHGRQPLFURVFRSHVOLGHVDQGFRQIRFDOLPDJHVZHUHDFTXLUHGDVGHVFULEHGEHORZ

,PPXQRVWDLQLQJ DQG LPDJLQJ 7LVVXH FXOWXUHV ZHUH IL[HG RYHUQLJKW LQ D VROXWLRQ RI ZY SDUDIRUPDOGHK\GH 3)$ LQ 3%6 SUHSDUHG IURP 3)$ VWRFNV LQ SKRVSKDWH EXIIHUHG VDOLQH DFFRUGLQJ WR PDQXIDFWXUHU¶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ǻ] PDWLGHDO1\TXLVWUDWH ,PDJH VWDFNV RI ,ED VWDLQHG HexB-tdTom FXOWXUHV )LJXUH ZHUH DFTXLUHG ZLWK D [ REMHFWLYHDW[RSWLFDO]RRP UHVROXWLRQ[S[ ,PDJHVWDFNVRI,EDVWDLQHGDFXWH FRUWLFDOVOLFHV )LJXUH ZHUHDFTXLUHGXVLQJD[RLOLPPHUVLRQREMHFWLYHDW[RSWLFDO ]RRP UHVROXWLRQ [ ǻ] P /DVHU LQWHQVLW\ DQG GHWHFWRU JDLQ ZHUH VHW WR DFKLHYH FRPSDUDEOH RYHUDOO IOXRUHVFHQFH LQWHQVLW\ WKURXJKRXW VWDFNV EHWZHHQ DOO JURXSV LQ HDFKH[SHULPHQWDOVHWWLQJ

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exBtdT/tdT DQGKHWHUR]\JRXV HexBtdT/+ FXOWXUHV SUHSDUHG IURP HexB-tdTom WUDQVJHQLF DQLPDOV ZDV SHUIRUPHG WR DVVHVV PLFURJOLD PRUSKRORJ\ DIWHU U06 )LJXUH &XOWXUHV ZHUH VWLPXODWHG DV GHVFULEHG DERYH U06 DQG VKDPVWLPXODWLRQ DQGLPDJLQJZDVVWDUWHGLPPHGLDWHO\LQLPDJLQJVROXWLRQXQGHUFRQWLQXRXV R[\JHQDWLRQ &22 )RUKRXUVHYHU\PLQXWHVD]VWDFNRIWKHVDPHFHOOZDV UHFRUGHGXVLQJD[ZDWHULPPHUVLRQREMHFWLYHZLWKǻ] ȝPDWLGHDO1\TXLVWUDWHDQGDQ

RSWLFDO]RRPRI[ UHVROXWLRQ[S[[OLQHDYHUDJH /DVHULQWHQVLW\DQGGHWHFWRU JDLQZHUHLQLWLDOO\VHWDQGZHUHNHSWFRQVWDQWRYHULPDJHDFTXLVLWLRQWLPH /LYHFHOO LPDJLQJ RI C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP) FXOWXUHV ZDV SHUIRUPHG WR PRQLWRU 71)ĮH[SUHVVLRQDIWHUU06DVDQLQGLFDWRURIQHXURLQIODPPDWLRQ )LJXUH &XOWXUHVZHUH VWLPXODWHG DV GHVFULEHG DERYH U06 DQG VKDP VWLPXODWLRQ DQG NHSW LQ WKH LQFXEDWRU DIWHU VWLPXODWLRQ $IWHU KRXUV D ]VWDFN RI HDFK FXOWXUH ZDV UHFRUGHG XVLQJ D [ ZDWHU LPPHUVLRQ REMHFWLYH ZLWK ǻ] ȝP DW LGHDO 1\TXLVW UDWH DQG DQ RSWLFDO ]RRP RI [ UHVROXWLRQ[S[ /DVHULQWHQVLW\DQGGHWHFWRUJDLQZHUHLQLWLDOO\VHWWRNHHSWKH IOXRUHVFHQWVLJQDOLQDG\QDPLFUDQJHWKURXJKRXWWKHH[SHULPHQWDQGZHUHNHSWFRQVWDQW &RQIRFDOLPDJHVWDFNVZHUHVWRUHGDVF]LILOHV

7UDQVFULSWRPH0LFURDUUD\7LVVXHFXOWXUHVWKDWZHUHFXOWLYDWHGRQRQHILOWHUPHPEUDQH FXOWXUHV ZHUHWUDQVIHUUHGDVRQHVDPSOHLQWR5/7EXIIHU 4,$*(1 DQG51$ZDVLVRODWHG DFFRUGLQJ WR WKH PDQXIDFWXUHU¶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Į $QWLERG\ '4: $QWLPV

,/$QWLERG\'4;$QWLPV&;&/$QWLERG\'47 $IWHUZDVKLQJVDPSOHVZHUH PHDVXUHG ZLWK D 0(62 4XLFN3OH[ 64 LQVWUXPHQW 0HVRVFDOH 'LVFRYHU\ 7KH UHVSHFWLYH SURWHLQ FRQFHQWUDWLRQV ZHUH GHWHUPLQHG XVLQJ WKH 06' ',6&29(5< :25.%(1&+VRIWZDUH 0HVRVFDOH'LVFRYHU\

51$ ,VRODWLRQ DQG 4XDQWLWDWLYH UHYHUVH WUDQVFULSWLRQ3&5 57T3&5 51$ LVRODWLRQ IRU T3&5 DQDO\VLV ZDV SHUIRUPHG DV IROORZV 7LVVXH FXOWXUHV WKDW ZHUH FXOWLYDWHG RQ RQH ILOWHUPHPEUDQH FXOWXUHV ZHUHWUDQVIHUUHGDVRQHVDPSOHLQWR51$3URWHFWLRQEXIIHU 1HZ (QJODQG %LRODEV DQG 51$ ZDV LVRODWHG DFFRUGLQJ WR WKH PDQXIDFWXUHU¶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apdh 0PBJ Tnf 0PBP Il6 0PBP Cxcl1 0PBP 7KH57T3&5SURWRFROZDVSHUIRUPHGDVIROORZVF\FOHRI&IRU PLQ F\FOH RI & IRU PLQ F\FOHV RI & IRU V DQG & IRU PLQ 2I HDFK VDPSOH WKUHH WHFKQLFDO UHSOLFDWHV ZHUH XVHG DQG QR DPSOLILFDWLRQ ZDV GHWHFWHG LQ QRQ WHPSODWH FRQWUROV $PSOLILFDWLRQ FXUYHV ZHUH H[FOXGHG IURP IXUWKHU DQDO\VLV LI HIILFLHQF\ YDOXHVZHUHOHVVWKDQRUH[FHHGHGDFFRUGLQJWRDXWRPDWHGFDOFXODWLRQE\WKH%LR5DG &);0DHVWURVRIWZDUHSDFNDJH'DWDZHUHH[SRUWHGDQGVWRUHGRQDFRPSXWHUDVSFUGILOHV

:KROHFHOOSDWFKFODPSUHFRUGLQJV:KROHFHOOSDWFKFODPSUHFRUGLQJVZHUHFDUULHGRXWDW & QHXURQV SHU FXOWXUH 3DWFK SLSHWWHV FRQWDLQHG LQ P0 .JOXFRQDWH +(3(6 .&O $730J *731D 32&UHDWLQH ZY ELRF\WLQ S+ ZLWK.2+P2VPZLWKVXFURVH KDYLQJDWLSUHVLVWDQFHRI0ȍ3\UDPLGDOQHXURQV ZHUH YLVXDOO\ LGHQWLILHG XVLQJ D /16FRSH /XLJV 1HXPDQQ HTXLSSHG ZLWK DQ LQIUDUHG GRWFRQWUDVWDQGD[ ZDWHULPPHUVLRQREMHFWLYH 1$2O\PSXV (OHFWURSK\VLRORJLFDO VLJQDOVZHUHDPSOLILHGXVLQJD0XOWLFODPS%DPSOLILHUGLJLWL]HGZLWKD'LJLGDWD% GLJLWL]HUDQGYLVXDOL]HGZLWKWKHS&ODPSVRIWZDUHSDFNDJH )RUZKROHFHOOSDWFKFODPSUHFRUGLQJVRI&$S\UDPLGDOQHXURQVLQWLVVXHFXOWXUHV WKH EDWK VROXWLRQ FRQWDLQHG LQ P0 1D&O .&O 1D+&2 1D+32 &D&O 0J&O DQG JOXFRVH D&6) DQG ZDVR[\JHQDWHG FRQWLQXRXVO\ &2 2 6SRQWDQHRXVH[FLWDWRU\SRVWV\QDSWLFFXUUHQWV V(36&V RI&$S\UDPLGDOQHXURQVZHUH UHFRUGHG LQ YROWDJHFODPS PRGH DW D KROGLQJ SRWHQWLDO RI P9 6HULHV UHVLVWDQFH ZDV PRQLWRUHG EHIRUH DQG DIWHU HDFK UHFRUGLQJ DQG UHFRUGLQJV ZHUH GLVFDUGHG LI WKH VHULHV UHVLVWDQFHUHDFKHG0ȍ)RUP(36&UHFRUGLQJVRI&$S\UDPLGDOQHXURQV'$39 ȝ0DE$EFDP %LFXFXOOLQH0HWKLRGLGH 0DE$EFDP DQG77; ȝ0%LRWUHQG ZHUHDGGHGWRWKHH[WHUQDOVROXWLRQ

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ȍ

0XOWLVFDOH PRGHOLQJ $ GLPHQVLRQDO PHVK PRGHO ZDV FUHDWHG ZLWK WZR FRPSDUWPHQWV LH EDWK VROXWLRQ DQG RUJDQRW\SLF WLVVXH FXOWXUH XVLQJ WKH ILQLWH HOHPHQW PHWKRG DQG WKH SURJUDP*PVK /RFDOPHVKUHVROXWLRQZDVLQFUHDVHGIURPWRXQLWVLQWKH &$UHJLRQRIWKHFXOWXUHLHUHJLRQRILQWHUHVW 52, ZKHUHQHXURQVZHUHSODFHG7KHILQDO PHVKFRQVLVWHGRIîQRGHVDQGîWHWUDKHGURQV7KHPHDQWHWUDKHGURQHGJH OHQJWK ZDV P LQ WKH 52, 7KH SK\VLFDO GLPHQVLRQV RI WKH PHVK PRGHO ZHUH DGDSWHG IURPWKHin vitro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µLQIOX[¶ IURP WKH VRPDWLF DQG GHQGULWLF FRPSDUWPHQWV 6KLULQSRXU HW DO :H DQDO\]HG WKH QXPEHU RI DFWLRQ SRWHQWLDOV FDOFLXP VSLNHV DQG WKHLU SHDN YDOXHV 6LPXODWLRQV ZHUH UXQ RQ D KLJK SHUIRUPDQFHFRPSXWHULQWKHVWDWHRI%DGHQ:UWWHPEHUJ*HUPDQ\ EZ+3&

([SHULPHQWDO'HVLJQDQG6WDWLVWLFDO$QDO\VLV 678'<'(6,*1 ,QWKLVVWXG\ZHXVHGDJHPDWFKHGRUJDQRW\SLFHQWRUKLQRKLSSRFDPSDOWLVVXHFXOWXUHVDQGa ZHHNVROG DGXOW PLFHRIHLWKHUVH[LQDSURVSHFWLYHVWXG\GHVLJQ7UHDWPHQWZLWK3/; ZDV XVHG WR GHSOHWH PLFURJOLD IURP RUJDQRW\SLF WLVVXH FXOWXUHV 9HKLFOHRQO\ WUHDWHG DJH PDWFKHG FXOWXUHV VHUYHG DV FRQWUROV LQ WKHVH H[SHULPHQWV )RU PLFURJOLD GHSOHWLRQ LQ DGXOW PLFH aZHHNVROG WUHDWPHQWZLWK%/=ZDVXVHG1RQWUHDWHGDQGYHKLFOHRQO\WUHDWHG PLFH RI WKH VDPH DJH ZHUH XVHG DV FRQWUROV LQ WKHVH H[SHULPHQWV ([FLWDWRU\ LQSXWV RQWR S\UDPLGDOQHXURQVZHUHHYDOXDWHGLQDJHPDWFKHGWLVVXHFXOWXUHVRUaZHHNVROGDGXOWPLFH DIWHU UHSHWLWLYH PDJQHWLF VWLPXODWLRQ 6KDP VWLPXODWHG DJHPDWFKHG WLVVXH FXOWXUHV RU a

ZHHNVROGPLFHVHUYHGDVFRQWUROV,QH[SHULPHQWVWKDWLQFOXGHGWUHDWPHQWZLWK77;71)Į RU,/YHKLFOHRQO\WUHDWPHQWVHUYHGDVFRQWURO

48$17,),&$7,21 )RU WKH DQDO\VLV RI PLFURJOLD FHOO GHQVLW\ DQG VSLQH GHQVLW\ FHOOV RU VSLQHV ZHUH FRXQWHG PDQXDOO\ LQ PD[LPXP LQWHQVLW\ SURMHFWLRQV RI WKH FRQIRFDO LPDJH VWDFNV XVLQJ WKH µ&HOO &RXQWHU¶SOXJLQRI)LMLLPDJHSURFHVVLQJSDFNDJH>DYDLODEOHDWKWWSVILMLVF 6FKLQGHOLQHW DO @ 6SLQHKHDGYROXPHVZHUHDVVHVVHGLQWKHFRQIRFDOLPDJHVWDFNVXVLQJWKH,PDULV[ YHUVLRQ VRIWZDUH7KHVXUIDFHWRROZLWKWKHµVSOLWWRXFKLQJREMHFW¶RSWLRQHQDEOHGZDV XVHGWRPHDVXUHWKHYROXPHRIVSLQHKHDGV)LOHVZHUHVWRUHGDVLPV &RQIRFDO LPDJHV RI 3, VWDLQHG FXOWXUHV ZHUH SURFHVVHG DQG DQDO\]HG XVLQJ WKH )LML LPDJHSURFHVVLQJSDFNDJH$IWHUEDFNJURXQGVXEWUDFWLRQ UROOLQJEDOOUDGLXVS[ LPDJHV ZHUH ELQDUL]HG DQG 3, SRVLWLYH SDUWLFOHV ZHUH GLVSOD\HG DQG FRXQWHG XVLQJ WKH µ$QDO\]H 3DUWLFOHV¶IXQFWLRQ9DOXHVZHUHQRUPDOL]HGWRWKHPHDQYDOXHRIWKHFRQWUROJURXS &RQIRFDO LPDJH VWDFNV RI KHWHUR]\JRXV C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP) FXOWXUHV ZHUH SURFHVVHG DQG DQDO\]HG DV SUHYLRXVO\ GHVFULEHG /HQ] HW DO XVLQJ WKH )LML LPDJH SURFHVVLQJ SDFNDJH 0HDQ IOXRUHVFHQFH LQWHQVLW\ RI WKH FXOWXUH DUHD ZDV QRUPDOL]HG WR WKH PHDQYDOXHRIIOXRUHVFHQFHLQWHQVLW\RIWKHVKDPVWLPXODWHGFXOWXUHV 'HQGULWLFPRUSKRORJLHVZHUHDVVHVVHGXVLQJWKH1HXUROXFLGDVRIWZDUH YHUVLRQ &HOOV ZHUH VHPLDXWRPDWLFDOO\ UHFRQVWUXFWHG ZLWK WKH µXVHU JXLGHG WUHH UHFRQVWUXFWLRQ¶ IXQFWLRQ 5HFRQVWUXFWLRQV ZHUH VDYHG DV '$7 ILOHV DQG DQDO\VLV ZDV SHUIRUPHGLQWKH1HXUROXFLGD([SORUHU YHUVLRQ 7R DQDO\]H PLFURJOLD PRUSKRORJ\ LQ HexB-tdTom FXOWXUHV FRQIRFDO LPDJH VWDFNV ZHUH SURFHVVHG DQG DQDO\]HG XVLQJ WKH )LML LPDJH SURFHVVLQJ SDFNDJH 2I HDFK ]VWDFN D PD[LPXP LQWHQVLW\ SURMHFWLRQ ZDV JHQHUDWHG DQG ELQDUL]HG XVLQJ WKH µ7UDLQDEOH :HND 6HJPHQWDWLRQ¶SOXJLQ $UJDQGD&DUUHUDVHWDO 7KHVDPHFODVVLILHUZDVDSSOLHGWRDOO LPDJHVRIWKHVDPHPLFURJOLDRYHUWKHUHFRUGHGK$IWHUUHPRYLQJRXWOLHUV UDGLXV S[ WKUHVKROG PLFURJOLD VFDQQLQJ GHQVLW\ DQG PLFURJOLD GRPDLQ RI HDFK LPDJH ZHUH PDQXDOO\DVVHVVHGDVSUHYLRXVO\GHVFULEHG 3IHLIIHUHWDO 9DOXHVZHUHQRUPDOL]HGWR WKHPHDQ )RU WKH DQDO\VLV RI PLFURJOLDO PRUSKRORJ\ LQ DFXWH PRXVH FRUWLFDO VOLFHV VWDFNV RI VLQJOHFHOOVZHUHDOVRSURFHVVHGDQGDQDO\]HGXVLQJWKH)LMLLPDJHSURFHVVLQJSDFNDJH)LUVW HDFK VWDFN ZDV SURFHVVHG XVLQJ WKH µGHVSHFNOH¶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µPLFURJOLDVSHFLILF¶ )LJXUH LIWKH\ZHUHSDUWRIKLJKO\VSHFLILFPLFURJOLDPDUNHUVIRXQGE\&KLXHWDO &KLXHWDO DQGµPLFURJOLDUHODWHG¶LIH[SUHVVLRQRIWKHVHJHQHVLQPLFURJOLDZDVUHSRUWHGLQWKHOLWHUDWXUH HOVHZKHUH$IXOOOLVWRIGLIIHUHQWLDOO\H[SUHVVHGJHQHVLQFOXGLQJSUHGLFWHGJHQHVLVSURYLGHG LQH[WHQGHGGDWDWDEOH 57T3&5 GDWD ZHUH DQDO\]HG DV SUHYLRXVO\ GHVFULEHG /HQ] HW DO ZLWK WKH %LR5DG &); 0DHVWUR VRIWZDUH SDFNDJH XVLQJ WKH ǻǻ&T PHWKRG ZLWK Gapdh DV UHIHUHQFHJHQH9DOXHV ZHUHQRUPDOL]HG WR WKH PHDQYDOXH RIWKHUHVSHFWLYHYHKLFOHWUHDWHG FRQWUROJURXS 0HVRVFDOH F\WRNLQH GHWHFWLRQ DVVD\ ZDV DQDO\]HG XVLQJ WKH 06' ',6&29(5< :25.%(1&+ SODWIRUP P51$SURWHLQ OHYHO FRUUHODWLRQV ZHUH YLVXDOL]HG E\ D OLQHDU UHJUHVVLRQILWDQGDQDO\]HGXVLQJQRQSDUDPHWULF6SHDUPDQ¶VFRUUHODWLRQFRHIILFLHQWV U

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'LJLWDO,OOXVWUDWLRQV)LJXUHVZHUHSUHSDUHGXVLQJ3KRWRVKRSJUDSKLFVVRIWZDUH $GREH6DQ -RVH&$86$ ,PDJHEULJKWQHVVDQGFRQWUDVWZHUHDGMXVWHG 5(68/76 3KDUPDFRORJLFGHSOHWLRQRIPLFURJOLDLQRUJDQRW\SLFWLVVXHFXOWXUHV

7RGHWHUPLQHWKHUROHRIPLFURJOLDLQU 7 06LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\RUJDQRW\SLFWLVVXH FXOWXUHV ZHUH WUHDWHG ZLWK WKH FRORQ\VWLPXODWLQJ IDFWRU UHFHSWRU &6)5 DQWDJRQLVW 3/; ZKLFK UHDGLO\ GHSOHWHV PLFURJOLD (OPRUH HW DO &ROHPDQ HW DO 7LVVXHFXOWXUHVFRQWDLQLQJWKHHQWRUKLQDOFRUWH[DQGWKHKLSSRFDPSXVZHUHH[SRVHGWRQ0 3/; IRU DW OHDVW GD\V in vitro VWDUWLQJ LPPHGLDWHO\ DIWHU WLVVXHFXOWXUH SUHSDUDWLRQ )LJXUH $ UREXVW DQG DOPRVW FRPSOHWH GHSOHWLRQ RI PLFURJOLD a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

&$ S\UDPLGDO QHXURQV LQ PLFURJOLDGHSOHWHG WLVVXH FXOWXUHV GR QRW H[SUHVV U06 LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\

0LFURJOLDGHSOHWHG WLVVXH FXOWXUHVDQG QRQGHSOHWHG FRQWURO FXOWXUHV ZHUH VWLPXODWHGZLWK D +]VWLPXODWLRQSURWRFROFRQVLVWLQJRISXOVHVDWPD[LPXPVWLPXODWRURXWSXWXVLQJ D0DJVWLP 5DSLGVWLPXODWRUHTXLSSHGZLWKDQ$LU)LOPFRLO )LJXUH 7KHGLVWDQFHIURP WKHFRLODQGWKHRULHQWDWLRQRIWKHVWLPXODWHGWLVVXHZLWKLQWKHHOHFWULFILHOGZHUHNHSWFRQVWDQW LQ DOO H[SHULPHQWV )LJXUH $ % &$ S\UDPLGDO QHXURQV ZHUH SDWFKHG DQG ĮDPLQR K\GUR[\PHWK\OLVR[D]ROHSURSLRQLF DFLG $03$ UHFHSWRUPHGLDWHG PLQLDWXUH H[FLWDWRU\SRVWV\QDSWLFFXUUHQWV P(36&V ZHUHUHFRUGHGKDIWHUVWLPXODWLRQ )LJXUH& 6KDPVWLPXODWHG FRQWUROV ZHUH WUHDWHG WKH VDPH ZD\ H[FHSW IRU VWLPXODWLRQ ,Q OLQH ZLWK SUHYLRXVZRUN 9ODFKRVHWDO/HQ]HWDO/HQ]HWDO +]U06LQGXFHG D UREXVW VWUHQJWKHQLQJ RI H[FLWDWRU\ V\QDSVHV LQ &$ S\UDPLGDO QHXURQV RI FRQWURO WLVVXH FXOWXUHV DV GHPRQVWUDWHG E\ LQFUHDVHG PHDQ P(36& DPSOLWXGH KDOI ZLGWK DUHD DQG

IUHTXHQF\ )LJXUH $& 0DQQ:KLWQH\ WHVW P(36& DPSOLWXGH S 8 P(36&KDOIZLGWKS8 P(36&DUHDS8 P(36&IUHTXHQF\ S8 DPSOLWXGHIUHTXHQF\SORW50WZRZD\$129$ZLWK6LGDN¶VPXOWLSOH FRPSDULVRQV S VWLPXODWLRQ ) S P(36& DPSOLWXGH ELQ ) &RQYHUVHO\ QR FKDQJHV LQ P(36&V ZHUH REVHUYHG LQ PLFURJOLDGHSOHWHG WLVVXH FXOWXUHV IROORZLQJ U06 )LJXUH '( 0DQQ:KLWQH\ WHVW P(36& DPSOLWXGH S 8 P(36&KDOIZLGWKS 8 P(36&DUHDS 8 P(36&IUHTXHQF\ S 8 DPSOLWXGHIUHTXHQF\SORW50WZRZD\$129$ZLWK6LGDN¶VPXOWLSOH FRPSDULVRQVS VWLPXODWLRQ ) S P(36&DPSOLWXGHELQ ) 7KHVHUHVXOWV GHPRQVWUDWHWKDWWKHSUHVHQFHRIPLFURJOLDLVUHTXLUHGIRUU06LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\

0LFURJOLDGHSOHWLRQGRHVQRWDIIHFWFHOOYLDELOLW\

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DSLFDO W S î DQGEDVDOGHQGULWHV W S î +RZHYHU WKH WUHDWPHQW KDG QR HIIHFW RQ HLWKHU WKH QXPEHU RI VSLNHV )LJXUH ' RU WKH SHDN DFWLRQ SRWHQWLDOYDOXHVLQDQ\FRPSDUWPHQW )LJXUH( :HFRQWLQXHGE\FRPSDULQJWKHSHDNFDOFLXPFRQFHQWUDWLRQYDOXHVH[WUDFWHGIURPWKH FRPSDUWPHQWVDQGWUHDWPHQWFRQGLWLRQV$VIRUWKHYROWDJHGDWDWKHZLQQLQJPRGHO ǻ%,& ) S î XWLOL]HGWKHFRPSDUWPHQWDVSUHGLFWRU$JDLQWKH DQDO\VLVUHYHDOHGVLJQLILFDQWO\ZHDNHUSHDNYDOXHVLQWKHDSLFDO W S î DQGEDVDOGHQGULWHV W S î +RZHYHUWKHWUHDWPHQWKDGQRPDMRUHIIHFWV RQWKHSHDNFDOFLXPFRQFHQWUDWLRQOHYHOVLQFRPSDUWPHQWVLQYHVWLJDWHG )LJXUH)

5HSHWLWLYHPDJQHWLFVWLPXODWLRQGRHVQRWDIIHFWVWUXFWXUDOSURSHUWLHVRIPLFURJOLD

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5HSHWLWLYH PDJQHWLF VWLPXODWLRQ WULJJHUV DQ DFWLYLW\GHSHQGHQW UHOHDVH RI SODVWLFLW\ SURPRWLQJF\WRNLQHVIURPPLFURJOLD

7KH SODVWLFLW\PRGXODWLQJ HIIHFWV RI F\WRNLQHV VHFUHWHG E\ PLFURJOLD XQGHU SK\VLRORJLFDO FRQGLWLRQVLHLQWKHDEVHQFHRIPDMRUFKDQJHVLQPLFURJOLDPRUSKRORJ\DQGLQIODPPDWLRQ DUH ZHOOHVWDEOLVKHG 7DQFUHGL HW DO 6WHOOZDJHQ DQG 0DOHQND 6DQWHOOR HW DO &DR HW DO +DEEDV HW DO 0DJJLR DQG 9ODFKRV &KDL HW DO +HLUDQG6WHOOZDJHQ/HQ]HWDO 6SHFLILFDOO\71)ĮDQG,/KDYHEHHQOLQNHG WRWKHDELOLW\RIQHXURQVWRH[SUHVVV\QDSWLFSODVWLFLW\ 7DQFUHGLHWDO6WHOOZDJHQDQG 0DOHQND5L]]RHWDO ,QWKLVFRQWH[WZHZHUHUHFHQWO\DEOHWRGHPRQVWUDWHWKDW ORZ FRQFHQWUDWLRQV RI 71)Į SURPRWH WKH DELOLW\ RI QHXURQV WR H[SUHVV V\QDSWLF SODVWLFLW\ 0DJJLR DQG 9ODFKRV 7KHUHIRUH ZH WKHRUL]HG WKDW +] U06 FRXOG WULJJHU DQ DFWLYLW\GHSHQGHQWSURGXFWLRQDQGRUVHFUHWLRQRI71)ĮDQGRWKHUF\WRNLQHVDWORZSODVWLFLW\ SURPRWLQJFRQFHQWUDWLRQV :H SHUIRUPHG T3&5DQDO\VHV DQG SURWHLQGHWHFWLRQ DVVD\V LQ +] VWLPXODWHG DQG VKDPVWLPXODWHGPLFURJOLDGHSOHWHGDQGQRQGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHV )LJXUH ,QGHHG +]U06WULJJHUHGDQLQFUHDVHLQ71)Į )LJXUH$ ,/ )LJXUH% DQG&;&/ )LJXUH & WKDW ZDV DEVHQW LQ PLFURJOLDGHSOHWHG WLVVXH FXOWXUHV GHWDLOHG VWDWLVWLFV SURYLGHG LQ 7DEOH $SRVLWLYHFRUUHODWLRQRISURWHLQOHYHOVDQGP51$OHYHOVZDVHYLGHQWIRU71)Į )LJXUH' ,/ )LJXUH( DQG&;&/ )LJXUH) LQWKHQRQGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHV GHWDLOHGVWDWLVWLFVSURYLGHGLQH[WHQGHGGDWDWDEOH ,Q RUGHU WR WHVW ZKHWKHU WKH U06LQGXFHG UHOHDVH RI F\WRNLQHV IURP PLFURJOLD LV DFWLYLW\GHSHQGHQWLQDGLIIHUHQWVHWRIQRQGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHVZHEORFNHGYROWDJHJDWHG VRGLXP FKDQQHOV ZLWK 0 77; GXULQJ WKH VWLPXODWLRQ )LJXUH ,QGHHG QR VLJQLILFDQW FKDQJHVLQ71)Į )LJXUH$ ,/ )LJXUH% DQG&;&/ )LJXUH& ²ERWKDWP51$ DQG SURWHLQ OHYHOV²ZHUH REVHUYHG LQ WKHVH H[SHULPHQWV .UXVNDO:DOOLV WHVW GHWDLOHG VWDWLVWLFVSURYLGHGLQH[WHQGHGGDWDWDEOH 7KHVHUHVXOWVVKRZWKDW+]U06LQGXFHV DQDFWLYLW\GHSHQGHQWUHOHDVHRIPLFURJOLDOF\WRNLQHV

6XEVWLWXWLRQRISODVWLFLW\SURPRWLQJF\WRNLQHVGXULQJVWLPXODWLRQUHVFXHVU06LQGXFHG V\QDSWLFSODVWLFLW\LQPLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHV

:H WKHQ WHVWHG ZKHWKHU WKH H[RJHQRXV VXEVWLWXWLRQ RI 71)Į DQG ,/ UHVFXHV WKH DELOLW\ RI &$ S\UDPLGDO QHXURQV WR H[SUHVV U06LQGXFHG V\QDSWLF SODVWLFLW\ LQ WKH DEVHQFH RI PLFURJOLD )LJXUH 71)Į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

FRQFHQWUDWLRQV RI 71)Į DQG ,/ XQGHU VKDP FRQGLWLRQV GLG QRW DIIHFW P(36& DPSOLWXGHV FRPSDUHGWRVKDPVWLPXODWHGPLFURJOLDGHSOHWHGFXOWXUHVWKDWZHUHQRWH[SRVHGWR71)ĮDQG ,/ RQO\ P(36& IUHTXHQFLHV ZHUH LQFUHDVHG LQ WLVVXH FXOWXUHV H[SRVHG RQO\ WR 71)Į DQG ,/ QVKDP FHOOVQVKDPF\WRNLQHV FHOOVP(36&DPSOLWXGHS$ VKDP YV S$ VKDPF\WRNLQHV QVP(36&IUHTXHQF\+] VKDP YV +] VKDPF\WRNLQHV S 0DQQ:KLWQH\WHVW :HFRQFOXGHWKDW71)ĮDQG,/ UHOHDVHGIURPPLFURJOLDGXULQJVWLPXODWLRQLVUHTXLUHGIRUU06LQGXFHGV\QDSWLFSRWHQWLDWLRQ

In vivoPLFURJOLDGHSOHWLRQSUHYHQWVU706LQGXFHGH[FLWDWRU\V\QDSWLFSODVWLFLW\LQWKH PRXVHP3)&

)LQDOO\ZHWHVWHGZKHWKHUWKHSUHVHQFHRIPLFURJOLDLVUHTXLUHGIRUU706LQGXFHGSODVWLFLW\ RI V\QDSWLF WUDQVPLVVLRQ in vivo 7KLPP DQG )XQNH /HQ] HW DO .ORRVWHUERHU DQG)XQNH In vivoPLFURJOLDGHSOHWLRQZDVDFKLHYHGWKURXJKGDLO\DSSOLFDWLRQRIWKH &6)5 LQKLELWRU %/= > PJ NJ RUDO JDYDJH IRU FRQVHFXWLYH GD\V SULRU WR H[SHULPHQWDO DVVHVVPHQW +DJHPH\HU HW DO 0DVXGD HW DO @ $QHVWKHWL]HG PLFURJOLDGHSOHWHGDQGQRQGHSOHWHGPLFHZHUHVWLPXODWHGZLWKWKHVDPH+]VWLPXODWLRQ SURWRFRO DV LQ RXU in vitro H[SHULPHQWV FI /HQ] HW DO 7ZR KRXUV DIWHU WKH VWLPXODWLRQIURQWDOEUDLQVHFWLRQVFRQWDLQLQJWKHPHGLDOSUHIURQWDOFRUWH[ZHUHSUHSDUHGDQG $03$UHFHSWRUPHGLWDWHGV(36&VZHUHUHFRUGHGIURPVXSHUILFLDOS\UDPLGDOQHXURQVRIWKH P3)& KRXUV SRVW VWLPXODWLRQ )LJXUH $ %/=LQGXFHG PLFURJOLD GHSOHWLRQ ZDV FRQILUPHGE\,EDVWDLQLQJVRIIURQWDOEUDLQVHFWLRQV aUHGXFWLRQLQFHOOGHQVLW\LQWKH %/=WUHDWHG DQLPDOV )LJXUH % 0DQQ:KLWQH\ WHVW S 8 :KLOH in vivo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²LI QRW UHYHUVHG²LQ WKH P3)& RI PLFURJOLDGHSOHWHG DQLPDOV )LJXUH & ' 50 WZRZD\$129$ZLWK6LGDN¶VPXOWLSOHFRPSDULVRQVFRQWUROS VWLPXODWLRQ ) S V(36&DPSOLWXGHELQV ) %/=S VWLPXODWLRQ ) S V(36&DPSOLWXGHELQV ) 'HVSLWH D VPDOO EXW VLJQLILFDQW GHFUHDVH LQ LQSXW UHVLVWDQFH XSRQ U706 LQ QRQ GHSOHWHGDQLPDOVWKHVHFKDQJHVRFFXUUHGLQWKHDEVHQFHRIPDMRUFKDQJHVLQSDVVLYH )LJXUH (0DQQ:KLWQH\WHVWUHVWLQJ PHPEUDQHSRWHQWLDOSFRQWURO 8FRQWURO S%/= 8%/= LQSXWUHVLVWDQFHSFRQWURO 8FRQWURO S%/= 8%/= DQGDFWLYH )LJXUH)50WZRZD\$129$ZLWK6LGDN¶V PXOWLSOH FRPSDULVRQVFRQWURO S VWLPXODWLRQ ) S FXUUHQWLQMHFWLRQ ) %/=S VWLPXODWLRQ ) S FXUUHQWLQMHFWLRQ ) PHPEUDQHSURSHUWLHVLQPLFURJOLDGHSOHWHGDQGQRQ GHSOHWHGDQLPDOV 6LPLODU WR RXU in vitro H[SHULPHQWV LQ KLSSRFDPSDO DUHD &$ QR U706LQGXFHG FKDQJHVLQPLFURJOLDPRUSKRORJLHVZHUHREVHUYHGLQWKHP3)&RIDQHVWKHWL]HGPLFH )LJXUH

* + 0DQQ:KLWQH\ WHVW SVFDQQLQJ GHQVLW\ 8VFDQQLQJ GHQVLW\ SPLFURJOLDO GRPDLQ ! 8 PLFURJOLDO GRPDLQ 7KHVH UHVXOWV GHPRQVWUDWH WKH HVVHQWLDO LH SODVWLFLW\ SURPRWLQJUROHRIPLFURJOLDIRUU706LQGXFHGFKDQJHVLQV\QDSWLFWUDQVPLVVLRQin vivo

',6&866,21

7KHH[SHULPHQWVRIWKLVVWXG\GHPRQVWUDWHWKDWWKHSUHVHQFHRIPLFURJOLDLVUHTXLUHGIRUWKH LQGXFWLRQRIV\QDSWLFSODVWLFLW\WULJJHUHGE\+]U706LQEUDLQWLVVXHRIPLFH in vitroDQG in vivo ,QWKLVFRQWH[WDIXQFWLRQDODFWLYDWLRQRIPLFURJOLDZDVREVHUYHGDVUHIOHFWHGE\WKH DFWLYLW\GHSHQGHQWJHQHH[SUHVVLRQDQGUHOHDVHRIF\WRNLQHVZKLOH PLFURJOLDO PRUSKRORJLHV DQGG\QDPLFVUHPDLQHGXQDIIHFWHG,QGHHGVXEVWLWXWLRQRI71)ĮDQG,/UHVFXHGWKHDELOLW\ RI QHXURQV WR H[SUHVV V\QDSWLF SODVWLFLW\ LQ PLFURJOLDGHSOHWHG EUDLQ WLVVXH FXOWXUHV 7KHVH UHVXOWV GHPRQVWUDWH WKDW U706 HIIHFWLYHO\ PRGXODWHV PLFURJOLD IXQFWLRQ LH F\WRNLQH UHOHDVHLQVWLPXODWHGEUDLQUHJLRQVWKHUHE\LGHQWLI\LQJDQRYHOPHFKDQLVPRIDFWLRQZKLFK PD\H[SODLQVRPHRIWKHEHQHILFLDOHIIHFWVRIU706LQKHDOWK\LQGLYLGXDOVDQGSDWLHQWV ,W KDV EHHQ SURSRVHG WKDW U706LQGXFHG DIWHUHIIHFWV DUH PHGLDWHG E\ ³/73OLNH´ SODVWLFLW\ PHFKDQLVPV =LHPDQQ 7KLV HYLGHQFH LV EDVHG RQ SK\VLRORJLFDO FKDUDFWHULVWLFVDQGSKDUPDFRORJLFDODQDORJLHVEHWZHHQVWXGLHVSHUIRUPHGDWWKHV\VWHPOHYHO LQ KXPDQ VXEMHFWV .RUFKRXQRY DQG =LHPDQQ =LHPDQQ HW DO %URZQ HW DO DQGGDWDREWDLQHGIURPDQLPDOPRGHOV +RRJHQGDPHWDO9ODFKRVHWDO 6SHFLILFDOO\ WKH HIIHFWV RI SKDUPDFRORJLFDO PRGXODWLRQ RI 10'$ UHFHSWRUV KDYH EHHQ LQWHUSUHWHG DV HYLGHQFH IRU ³/73OLNH´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²DW OHDVWLQSDUW²E\WKHPRGXODWLRQRIFDOFLXPVLJQDOLQJSDWKZD\VLQQHXURQVDQGLQPLFURJOLD ,Q OLQH ZLWK WKLV VXJJHVWLRQ LQ WKLV VWXG\ ZH SURYLGHG HYLGHQFH IRU DQ DFWLYLW\GHSHQGHQW H[SUHVVLRQDQGUHOHDVHRISODVWLFLW\SURPRWLQJF\WRNLQHVXSRQ+]U063KDUPDFRORJLFDO LQKLELWLRQRIVRGLXPFKDQQHOVZLWK77;EORFNHGF\WRNLQHSURGXFWLRQDQGUHOHDVH0RUHRYHU WKH GHWULPHQWDO HIIHFWV RI PLFURJOLDGHSOHWLRQ RQ U06LQGXFHG V\QDSWLF SODVWLFLW\ ZHUH UHVFXHG ZKHQ WKH DFWLYLW\GHSHQGHQW F\WRNLQHV 71)Į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ĮDQG,/GXULQJVWLPXODWLRQZDVVXIILFLHQWWRUHVWRUHU06 LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\LQWKHDEVHQFHRIPLFURJOLD,WVKRXOGEHQRWHGKRZHYHUWKDWWKH HIIHFW RI +] U06 LQ PLFURJOLDGHSOHWHG FXOWXUHV ZHUH QRW UHVFXHG FRPSOHWHO\ LH WR WKH OHYHORIQRQGHSOHWHGVWLPXODWHGFXOWXUHVE\71)ĮDQG,/GXULQJWKHVWLPXODWLRQ:KLOHLW LVGLIILFXOWWRGHWHUPLQHWKHH[DFWFRQFHQWUDWLRQVRI71)ĮDQG,/DWV\QDSWLFVLWHVLWLVOLNHO\ WKDW DGGLWLRQDO PLFURJOLDO PHFKDQLVPV HJ VLJQDOV PHGLDWHG GXULQJ SK\VLFDO FRQWDFWV EHWZHHQPLFURJOLDDQGV\QDSVHVPD\FRQWULEXWHWRU706LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\ 3UHYLRXV VWXGLHV KDYH GHPRQVWUDWHG WKDW SURLQIODPPDWRU\ F\WRNLQHV LQIOXHQFH H[FLWDWRU\QHXURWUDQVPLVVLRQ 6WHOOZDJHQDQG0DOHQND&DRHWDO6WUHKOHWDO 5LD]L HW DO 0DJJLR DQG 9ODFKRV 6KHSSDUG HW DO 6SHFLILFDOO\ 71)Į DQG ,/ KDYH EHHQ LPSOLFDWHG DV LPSRUWDQW VHFUHWHG IDFWRUV WKDW PRGXODWH V\QDSWLF WUDQVPLVVLRQ )XUXNDZD DQG 0DWWVRQ 6WHOOZDJHQ HW DO *DUFLD2VFRV HW DO DQGSODVWLFLW\ +HLUDQG6WHOOZDJHQ ,QWKLVFRQWH[WLWKDVEHHQVKRZQWKDW71)Į DFWV DV D SHUPLVVLYH IDFWRU 6WHLQPHW] DQG 7XUULJLDQR %HFNHU HW DO ZKHUH 71)Įper seGRHVQRWWULJJHUPDMRUFKDQJHVLQSRVWV\QDSWLFVWUHQJWKUDWKHULWPRGXODWHVWKH DELOLW\ RI QHXURQV WR H[SUHVV SODVWLFLW\ ZLWKRXW DIIHFWLQJ EDVHOLQH V\QDSWLF WUDQVPLVVLRQ² EHVLGHV FKDQJHV LQ SUHV\QDSWLF JOXWDPDWH UHOHDVH 6DQWHOOR HW DO DVDOVR UHIOHFWHG E\ WKHLQFUHDVHGP(36&IUHTXHQFLHVVHHQLQRXUH[SHULPHQWVLQZKLFKPLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXH FXOWXUHV ZHUH H[SRVHG WR 71)Į DQG ,/ ZLWKRXW HOHFWURPDJQHWLF VWLPXODWLRQ ,QGHHG H[SHULPHQWVHPSOR\LQJFODVVLFWHWDQLFHOHFWULFVWLPXODWLRQVKRZHGWKDWORZFRQFHQWUDWLRQVRI 71)ĮUDSLGO\SURPRWH/73LQGXFWLRQZKLOHKLJKFRQFHQWUDWLRQVRI71)ĮLPSHGHWKHDELOLW\ RI QHXURQV WR H[SUHVV /73 ZLWKRXW DIIHFWLQJ EDVHOLQH V\QDSWLF WUDQVPLVVLRQ 0DJJLR DQG 9ODFKRV 7KHVH ILQGLQJV DUH FRQVLVWHQW ZLWK WKH PHWDSODVWLF HIIHFWVRI 71)Į ,Q OLQH ZLWKWKLVVXJJHVWLRQSDWKRORJLFDODFWLYDWLRQRIPLFURJOLDZLWKEDFWHULDOOLSRSRO\VDFFKDULGHV ZKLFK WULJJHUV VWURQJ 71)Į SURGXFWLRQ LH a± IROG LQFUHDVH LQ 71)ĮP51$ DQG aIROGLQFUHDVHLQ71)ĮSURWHLQOHYHOVRFFOXGHVWKHDELOLW\RI&$S\UDPLGDOQHXURQVWR H[SUHVV+]U06LQGXFHGV\QDSWLFSODVWLFLW\ /HQ]HWDO 7RJHWKHUZLWKWKHUHVXOWV RI WKH SUHVHQW VWXG\ WKHVH ILQGLQJV GHPRQVWUDWH WKDW PLFURJOLD KDYH DQ LPSRUWDQW UROH LQ

U706LQGXFHG V\QDSWLF SODVWLFLW\ 7KLV FDOOV IRU D V\VWHPDWLF DVVHVVPHQW RI U706LQGXFHG PLFURJOLDSODVWLFLW\DQGUDLVHVWKHLQWULJXLQJSRVVLELOLW\WKDWU706UHFUXLWVPHWDSODVWLFLW\E\ DFWLYDWLQJ PLFURJOLD +HQFH VRPH RI WKH EHQHILFLDO HIIHFWV RI U706 VHHQ LQ SDWLHQWV PD\ UHVLGH²DWOHDVWLQSDUW²LQWKHHIIHFWVRIU706RQPLFURJOLDIXQFWLRQZKLFKDOVRVHHPWREH LQYROYHG LQ SURPRWLQJ WKH DELOLW\ RI QHXURQV WR H[SUHVV ³/73OLNH´ SODVWLFLW\ VKRUWO\ DIWHU VWLPXODWLRQ

$FNQRZOHGJHPHQWV:HWKDQN6LPRQH=HQNHUIRUVNLOOIXOWHFKQLFDODVVLVWDQFHDQGWKH1H[W *HQHUDWLRQ6HTXHQFLQJ&RUH)DFLOLW\ 1*6&))DFXOW\RI0HGLFLQH8QLYHUVLW\RI)UHLEXUJ IRU DVVLVWDQFH LQ WUDQVFULSWRPH DQDO\VLV 7KH DXWKRUV DOVR DFNQRZOHGJH WKH VXSSRUW E\ WKH VWDWH RI %DGHQ:UWWHPEHUJ WKURXJK WKH SRVVLELOLW\ RI XVLQJ KLJK SHUIRUPDQFH FRPSXWLQJ UHVRXUFHV EZ+3&EZ8QL&OXVWHU

)XQGLQJ7KLVZRUNZDVVXSSRUWHGE\027,9$7(JUDGXDWHVFKRRO)DFXOW\RI0HGLFLQH 8QLYHUVLW\ RI )UHLEXUJ WR $( WKH (48,3 0HGLFDO 6FLHQWLVW 3URJUDPPH )DFXOW\ RI 0HGLFLQH8QLYHUVLW\RI)UHLEXUJ WR0/ )DFXOW\RI0HGLFLQHRIWKH8QLYHUVLW\RI)UHLEXUJ 785 WR =7 DQG 'HXWVFKH )RUVFKXQJVJHPHLQVFKDIW ')* 3URMHFW,' %±&5&755WR$9

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' 0LFURJOLDFHOOFRXQWVLQWKHUHVSHFWLYHJURXSV QFRQWURO FXOWXUHVQ3/; FXOWXUHV 0DQQ:KLWQH\WHVW8

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,QGLYLGXDOGDWDSRLQWVDUHLQGLFDWHGE\FRORUHGGRWV9DOXHVUHSUHVHQWPHDQVHP S )LJXUH+]UHSHWLWLYHPDJQHWLFVWLPXODWLRQLQRUJDQRW\SLFWLVVXHFXOWXUHV

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& 6KDP VWLPXODWHG FXOWXUHV ZHUH QRW VWLPXODWHG EXW RWKHUZLVH WUHDWHG HTXDOO\ $IWHU VWLPXODWLRQ FXOWXUHV ZHUH NHSW LQ WKH LQFXEDWRU IRU K EHIRUH IXUWKHU H[SHULPHQWDO SURFHGXUHVOLNHSDWFKFODPSUHFRUGLQJV

)LJXUH&$ S\UDPLGDO QHXURQV LQ PLFURJOLDGHSOHWHG WLVVXHFXOWXUHV GR QRWH[SUHVV H[FLWDWRU\V\QDSWLFSODVWLFLW\LQGXFHGE\+]UHSHWLWLYHPDJQHWLFVWLPXODWLRQ U06

$ ([DPSOH RI D UHFRUGHG DQG SRVWKRF VWDLQHG &$ S\UDPLGDO QHXURQ LQ D WLVVXH FXOWXUH VWDLQHGZLWKWKHPLFURJOLDOPDUNHU,ED6FDOHEDUP

% & 6DPSOH WUDFHV DQG JURXS GDWD RI $03$ UHFHSWRUPHGLDWHG PLQLDWXUH H[FLWDWRU\ SRVWV\QDSWLF FXUUHQWV P(36&V UHFRUGHG IURP &$ S\UDPLGDO QHXURQV LQ VKDPVWLPXODWHG DQG+]U06VWLPXODWHGFXOWXUHVKDIWHUVWLPXODWLRQ QFRQWUROVKDP FHOOVQFRQWUROU06 FHOOV0DQQ:KLWQH\WHVW8DPSOLWXGH 8KDOIZLGWK 8DUHD 8IUHTXHQF\ 50 WZRZD\ $129$ IROORZHG E\ 6LGDN¶V PXOWLSOH FRPSDULVRQV WHVW IRU DPSOLWXGH IUHTXHQF\SORW

' ([DPSOHRIDUHFRUGHGDQGSRVWKRFVWDLQHG&$S\UDPLGDOQHXURQLQD3/;WUHDWHG PLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHVWDLQHGZLWKWKHPLFURJOLDOPDUNHU,ED6FDOHEDUP

() 5HSUHVHQWDWLYHWUDFHVDQGJURXSGDWDRI$03$UHFHSWRUPHGLDWHGP(36&VUHFRUGHG IURP&$S\UDPLGDOFHOOVLQVKDPVWLPXODWHGDQG+]U06VWLPXODWHGPLFURJOLDGHSOHWHG WLVVXHFXOWXUHVKDIWHUVWLPXODWLRQ Q3/;VKDP FHOOVQ3/;U06 FHOOV0DQQ :KLWQH\ WHVW 50 WZRZD\ $129$ IROORZHG E\ 6LGDN¶V PXOWLSOH FRPSDULVRQV WHVW IRU DPSOLWXGHIUHTXHQF\SORW

,QGLYLGXDOGDWDSRLQWVDUHLQGLFDWHGE\JUH\GRWV9DOXHVUHSUHVHQWPHDQVHP SQVQRWVLJQLILFDQWGLIIHUHQFHV S

)LJXUH 'HSOHWLRQ RI PLFURJOLD GRHV QRW DIIHFW FHOO YLDELOLW\ DQG EDVLF IXQFWLRQDO SURSHUWLHVRI&$S\UDPLGDOQHXURQV

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) *URXS GDWD RI $03$ UHFHSWRUPHGLDWHG VSRQWDQHRXV H[FLWDWRU\ SRVWV\QDSWLF FXUUHQWV V(36&V UHFRUGHG IURP &$ S\UDPLGDO QHXURQV UHYHDOHG QR VLJQLILFDQW FKDQJHV LQ H[FLWDWRU\QHXURWUDQVPLVVLRQLQPLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHV QFRQWURO FHOOVQ3/; FHOOV0DQQ:KLWQH\WHVW

,QGLYLGXDO GDWD SRLQWV DUH LQGLFDWHG E\ JUH\ GRWV 9DOXHV UHSUHVHQW PHDQ VHP QVQRWVLJQLILFDQWGLIIHUHQFHV S

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&( *URXSGDWDRIDGGLWLRQDOPRUSKRORJLFDOSDUDPHWHUVIURPWKHVDPHVHWRIUHFRQVWUXFWHG &$S\UDPLGDOQHXURQVLQPLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHVDQGYHKLFOHRQO\WUHDWHGFRQWURO FXOWXUHV QFRQWURO FHOOVQ3/; FHOOV0DQQ:KLWQH\WHVW

,QGLYLGXDO GDWD SRLQWV DUH LQGLFDWHG E\ JUH\ GRWV 9DOXHV UHSUHVHQW PHDQVHP QV QRW VLJQLILFDQWGLIIHUHQFHV

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,QGLYLGXDO GDWD SRLQWV DUH LQGLFDWHG E\ JUH\ GRWV 9DOXHV UHSUHVHQW PHDQ VHP QV QRW VLJQLILFDQWGLIIHUHQFHV )LJXUH0XOWLVFDOHFRPSXWHUPRGHOLQJRIUHSHWLWLYHPDJQHWLFVWLPXODWLRQ U06

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' %RWKWKHQXPEHURIFHOOXODUVSLNHVXSRQVWLPXODWLRQDQGWKHV\QDSWLFZHLJKWGLGQRWVKRZ D VLJQLILFDQW GLIIHUHQFH EHWZHHQ &$ S\UDPLGDO QHXURQV IURP PLFURJOLDGHSOHWHG DQG QRQ GHSOHWHGFRQWUROFXOWXUHV QYHKLFOHRQO\ FHOOVQ3/; FHOOVJHQHUDOL]HGOLQHDUPL[HG PRGHOV

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) $QDO\VLVRIVWLPXOXVWULJJHUHGFKDQJHVLQLQWUDFHOOXODUFDOFLXPOHYHOV1RFKDQJHVLQERWK WKHGHQGULWLFDQGWKHVRPDWLFFRPSDUWPHQWVZHUHHYLGHQWEHWZHHQ&$S\UDPLGDOQHXURQVRI PLFURJOLDGHSOHWHGWLVVXHFXOWXUHVDQGFRQWUROFXOWXUHV

,QGLYLGXDO GDWD SRLQWV DUH LQGLFDWHG E\ JUH\ GRWV 9DOXHV UHSUHVHQW PHDQ VHP QV QRW VLJQLILFDQWGLIIHUHQFH )LJXUH5HSHWLWLYHPDJQHWLFVWLPXODWLRQ U06 GRHVQRWDIIHFWPLFURJOLDPRUSKRORJ\

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%' ([DPSOHV RI WG7RPDWR H[SUHVVLQJ PLFURJOLD LQ KLSSRFDPSDO DUHD &$ LPDJHG IURP HexBtdT/tdT FXOWXUHV RYHU D SHULRG RI WKUHH KRXUV IROORZLQJ +] U06 PLQ LQWHUYDOV 0D[LPXP LQWHQVLW\ SURMHFWLRQV RI LPDJHVWDFNV % PLFURJOLDO VFDQQLQJ GHQVLWLHV & DQG PLFURJOLDOGRPDLQV ' DUHLOOXVWUDWHG6FDOHEDUVP

( *URXSGDWDRIPLFURJOLDOGRPDLQVDQGVFDQQLQJGHQVLWLHVIURPU06VWLPXODWHGDQGVKDP VWLPXODWHGWLVVXHFXOWXUHV QVKDP FHOOVQU06 FHOOVIURPFXOWXUHVLQHDFKJURXS50 WZRZD\$129$IROORZHGE\6LGDN¶VPXOWLSOHFRPSDULVRQV

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研究论文：发育/可塑性/修复

小胶质细胞因子介导10 Hz重复磁刺激诱导的可塑性 https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2226-22.2023 引用格式：J. Neurosci 2023; 10.1523/JNEUROSCI.2226-22.2023 收稿日期：2022年12月4日修订日期：2023年2月15日接受日期：2023年3月10日

本早期发表文章已经过同行评审和接受，但尚未经过排版和编辑加工过程。最终版本可能在格式或排版上略有差异，并将包含指向任何扩展数据的链接。提醒：请访问 www.jneurosci.org/alerts 注册，以便在本文完整格式版本发表时接收定制的电子邮件提醒。

Amelie Eichler¹, Dimitrios Kleidonas¹,²,³, Zsolt Turi¹, Maximilian Fliegeau⁷,⁸, Matthias Kirsch¹, Dietmar Pfeifer⁹, Takahiro Masuda⁷,¹⁰, Marco Prinz⁷,¹¹,¹², Maximilian Lenz¹,¹³, Andreas Vlachos¹,¹⁰,¹³

¹ 弗莱堡大学生物学与医学研究生院，德国弗莱堡 ² 弗莱堡大学生物学系，德国弗莱堡 ³ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁴ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁵ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁶ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁷ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁸ 弗莱堡大学医学院神经病理学研究所，德国弗莱堡 ⁹ 弗莱堡大学医学中心血液学、肿瘤学与干细胞移植科，德国弗莱堡 ¹⁰ 弗莱堡大学医学院分子与系统药理学系，日本九州大学，福冈 812-8582，日本 ¹¹ 弗莱堡大学信号研究中心 BIOSS 和 CIBSS，德国弗莱堡 ¹² 弗莱堡大学医学院神经调节基础研究中心 NeuroModulBasics，德国弗莱堡 ¹³ 弗莱堡大学 BrainLinks-BrainTools 中心，德国弗莱堡 * 共同通讯作者

通讯作者： Andreas Vlachos, M.D. 神经解剖学系解剖学与细胞生物学研究所弗莱堡大学医学院 Albertstraße 17 79104 弗莱堡，德国电子邮件：andreas.vlachos@anat.uni-freiburg.de

**意义声明**

重复经颅磁刺激（rTMS）是一种非侵入性脑刺激技术，可诱导皮层可塑性。尽管其在神经科学和临床实践中广泛应用，例如抑郁症治疗，但rTMS介导可塑性的细胞和分子机制仍不清楚。在此，我们报道了小胶质细胞及可塑性促进因子在10 Hz rTMS诱导的离体脑片培养物和可麻醉小鼠突触可塑性中的重要作用，从而确定了rTMS干预的靶点——小胶质细胞介导的突触适应。

小胶质细胞——中枢神经系统的固有免疫细胞——感知神经元活动并调节生理性脑功能。它们已被证明参与与神经兴奋性和可塑性改变相关的脑疾病病理过程。然而，目前尚缺乏能够以脑区特异性方式调控小胶质细胞功能的实验和治疗手段。在本研究中，我们测试了重复经颅磁刺激（rTMS）——一种临床常用的非侵入性脑刺激技术——对小胶质细胞介导的突触可塑性的影响。10 Hz电磁刺激触发了小胶质细胞释放可塑性促进因子，来源于雌雄小鼠的离体脑组织培养物中，而未观察到小胶质细胞形态或动力学的显著变化。事实上，肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-6（IL-6）的替代保留了无小胶质细胞条件下10 Hz刺激诱导的突触可塑性。与这些发现一致，体内小胶质细胞耗竭消除了rTMS诱导的麻醉小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）神经传递变化。我们得出结论：rTMS通过调节小胶质细胞释放的因子来影响神经兴奋性和可塑性。

关键词：小胶质细胞，rTMS，小胶质细胞耗竭，兴奋性突触可塑性，TNFα

**引言**

尽管重复经颅磁刺激（rTMS）在临床中的应用日益广泛，例如用于治疗难治性抑郁症，但其细胞和分子效应仍不清楚（Müller-Dahlhaus and Vlachos, 2016; Cirillo et al., 2017）。然而，众所周知，非侵入性磁脑刺激可调节皮层回路中的神经兴奋性和突触传递（Pell et al., 2011）。这些变化需要神经元活动，即动作电位诱导和钙依赖性信号通路，例如NMDA受体和L型电压门控钙通道（Lenz et al., 2018）。这些变化与突触神经传递的长时程增强（LTP）一致（Vlachos et al., 2015）。然而，目前尚不清楚rTMS及"类LTP"可塑性如何在临床环境中发挥积极作用。

近期研究表明，小胶质细胞——大脑的固有免疫细胞——感知并调节突触传递和可塑性（Schaefer et al., 2015; Badimon et al., 2020; Nebeling et al., 2021）。有证据表明，网络活动可调节小胶质细胞状态（Pfeiffer et al., 2016; Stowell et al., 2018）。这些变化反映在小胶质细胞过程的动态延伸和回缩、小胶质细胞与神经元之间物理接触的形成，以及活动依赖性可塑性调节因子的分泌（Akioshi et al., 2015; Sheppard et al., 2016; Cserép et al., 2020）。具体而言，促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素-6（IL-6）的可塑性调节作用已在多种实验设置中得到证实，包括体外和体内研究（Stellwagen and Malenka, 2006; Santello et al., 2011; Heir and Stellwagen, 2020）。这些发现表明，小胶质细胞在神经功能和可塑性中发挥重要作用。考虑到其在病理性脑状态中的作用（Graebner and Streit, 2010; Prinz et al., 2016; Prinz et al., 2021），有趣的是，rTMS的治疗效果可能至少部分依赖于对小胶质细胞功能的调节。事实上，已有证据表明rTMS影响小胶质细胞标志物（Cullen and Young, 2016; Clarke et al., 2017; Stevanovic et al., 2016; Muri et al., 2020; Li et al., 2021）。然而，目前尚无直接实验证据确定小胶质细胞在rTMS诱导的神经可塑性中的作用。

为了解决小胶质细胞在rTMS诱导的突触可塑性中的生物学相关性，我们从离体脑组织培养物和成年小鼠脑中耗竭了小胶质细胞，并使用10 Hz刺激方案探测了突触可塑性。反过来，我们测试了10 Hz磁刺激对小胶质细胞结构和功能特性的影响，并采用体外细胞因子释放测定来鉴定rTMS后小胶质细胞分泌的可塑性促进因子。

**伦理声明**

小鼠维持在12小时光暗循环中，食物和水可自由获取。已尽一切努力减少动物的痛苦和疼痛。所有实验程序均根据德国动物福利法规进行，并获得主管当局批准（Regierungspräsidium Freiburg, G-20/147），由适当的动物福利委员会和弗莱堡大学医学院动物福利官员监督（X-16/03K, X-16/09C, X-17/03C, X-17/05C）。

**组织培养制备**

如前所述，从出生后第6-8天的C57BL/6J、HexB-tdTom（Masuda et al., 2020）和C57BL/6Tg(TNFa-eGFP)（Lenz et al., 2020）小鼠制备延髓-海马组织培养物，雌雄不限（Del Turco and Dell, 2003）。培养培养基含有80%（v/v）MEM、25%（v/v）基础培养基Eagle、25%（v/v）热灭活正常马血清、10 mM HEPES缓冲液、0.15%（w/v）碳酸氢钠、0.25%（w/v）葡萄糖、1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素和5 mM谷氨酰胺。pH值调整为7.4。所有组织培养物在含5% CO₂的湿润环境中于37°C下成熟至少14天。每周更换三次培养基。

**小胶质细胞耗竭（体外和体内）**

组织培养物在制备后第3天立即用CSF-1R抑制剂PLX5628（50 nM；Axon Medchem）处理至少14天。仅用载体处理的培养物（DMSO，0.1%）作为年龄和时间匹配的对照组。对于体内小胶质细胞耗竭，我们使用CSF-1R抑制剂BLZ945（由诺华公司，瑞士巴塞尔提供），溶解于20%（w/v）2-羟丙基-β-环糊精（Sigma-Aldrich，德国）。以200 mg/kg体重的剂量通过口服灌胃给予8周龄成年小鼠，连续5天，如前所述（Hagemeyer et al., 2016; Masuda et al., 2020）。在整个治疗期间未检测到体重减轻或任何明显的应激迹象。仅用载体处理和未处理的动物用作对照组。

**重复磁刺激（体外）**

为了更好地理解rTMS诱导可塑性的细胞和分子机制，我们建立了使用小鼠延髓-海马切片培养物的体外rTMS模型，该模型提供了高度层状纤维和细胞架构的优势（Frotscher and Heimrich, 1984; Maus et al., 2020; Lenz et al., 2021），这些制备的优缺点已在前文讨论（Vlachos et al., 2015）。这种方法使我们能够在嵌入类器官神经元网络中的单个已识别神经元水平评估rTMS诱导的突触可塑性，参见Müller-Dahlhaus和Vlachos（2016）。此外，近期工作证实了类器官切片培养物中小胶质细胞特征和功能的维持，类似于体内所见（Delbridge et al., 2020）。将培养≥14天的组织培养物转移至含有预热标准细胞外溶液的60 mm培养皿中，该溶液包含（mM）：150 NaCl、3 KCl、1.5 MgCl₂、2 CaCl₂、10葡萄糖、10 HEPES、1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素，pH 7.4，用NaOH调节，渗透压用蔗糖调节至300-310 mOsm。使用MagStim Rapid²刺激器（MagStim Company, UK）连接双空气膜线圈，根据制造商描述设置线圈参数：平均电感~15 μH，脉冲上升时间约50 μs，脉冲持续时间=0.4 ms，双相；MagStim Company, UK，具有双相电流波形。培养物定位于线圈中心下方约1 cm处，方向设置为诱导电场平行于CA1锥体神经元的树突树。刺激方案由100个脉冲组成，频率为10 Hz，最大刺激器输出的80%。培养物在刺激后至少保持在培养箱中2小时，然后进行实验评估。年龄和时间匹配的对照组培养物未受刺激，但其他处理方式相同（假刺激）。对于细胞因子替代实验，将TNFα（5 ng/ml；R&D Systems）和IL-6（1.8 ng/ml；R&D Systems）加入刺激培养基中。

**重复磁刺激（体内）**

rTMS在8周龄成年异氟烷麻醉（1.5-2.5%，静脉注射0.1-0.5 mg/kg，皮下注射）的C57BL/6J小鼠中进行，雌雄不限。头部置于线圈下方，内侧前额叶皮层（mPFC）位于中心。在刺激过程中，保持脑-线圈距离最小，同时避免脑-线圈接触。重复刺激在固定强度下进行，为最大刺激器输出的90%，对应于90%运动阈值，参见Lenz et al.（2019），使用上述相同的10 Hz刺激方案。对照组动物在刺激期间置于线圈附近，但未受刺激，但其他处理方式相同。所有动物在适当的体温控制下被转移回笼中，并在麻醉下保持2小时，持续监测。在等待期后，注射氯胺酮/甲苯噻嗪（100 mg/kg，静脉注射；5 mg/kg，腹腔注射）以实现适当的镇痛，然后快速断头。

如前所述制备大脑（Ting et al., 2015; Lenz et al., 2020）。解剖后，将大脑嵌入低熔点琼脂（1.5%，w/v，PBS中；Sigma-Aldrich #A4816），并使用Leica VT1500S振动切片机在15°切割角下制备包含mPFC的600 μm厚冠状切片。大脑在NMDG-ACSF中切割，该溶液包含（mM）：95 NMDG、1.8 KCl、1.5 NaH₂PO₄、30 NaHCO₃、20 HEPES、25葡萄糖、5硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、0.5 CaCl₂和10 MgSO₄，pH 7.4±0.5，在约0°C下。切割后，切片在NMDG-ACSF中于37°C下恢复。如前所述进行钠内流实验，该实验适用于8周龄动物（Ting et al., 2015; Lenz et al., 2020）。恢复后，将切片转移至含有（mM）95 NaCl、1.8 KCl、1.5 NaH₂PO₄、30 NaHCO₃、20 HEPES、25葡萄糖、5硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、2 CaCl₂和2 MgSO₄（pH 7.4±0.5）的保持室中，在室温下维持至少半小时，直到电生理评估。

**碘化丙啶染色**

将组织培养物与碘化丙啶（PI，5 μg/ml；Sigma-Aldrich #P4170）孵育2小时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并如下所述固定。用NMDA（50 μg/ml；Tocris #0114）处理7小时的培养物在这些实验中用作阳性对照。细胞核用DAPI染色，切片封片在显微镜载玻片上，如下所述获取共聚焦图像。

**免疫染色和成像**

将组织培养物在PBS中用4%（w/v）多聚甲醛（PFA）固定过夜，根据制造商说明从15% PFA储备液在磷酸盐缓冲盐水中制备（Thermo Scientific #28906）。固定后，将培养物在PBS（0.1 M，pH 7.4）中洗涤，并连续在含10%（v/v）正常山羊血清（NGS）的0.1%（v/v）Triton X-100 PBS中孵育1小时，以减少非特异性染色并增加抗体渗透。随后，将培养物在含10% NGS和0.1% Triton X-100的PBS中于4°C下与兔抗-Iba1（1:1000；Fujifilm Wako #019-19741）孵育过夜。切片洗涤并在4°C下与适当的Alexa Fluor®染料标记的二抗（1:1000，驴抗兔Alexa Fluor 594或488；Invitrogen #A-21207或#A-31572）孵育过夜。对于转染的锥体细胞的事后可视化，将链霉亲和素Alexa Fluor 594或466（1:1000；Invitrogen #S-32355或#S-21374）加入二抗孵育溶液中。DAPI核染色（1:5000）在PBS中孵育20分钟（Thermo Scientific #62248）用于可视化细胞架构。将培养物洗涤，转移至玻璃载玻片上，并用DABCO抗封片剂封片（Agilent #S36938）。

使用配备有20×多浸没物镜（NA 0.75；Leica）、70×油浸物镜（NA 1.40；Leica）和63×油浸物镜（NA 1.60；Leica）的Leica SP5激光扫描显微镜获取共聚焦图像。用于分析小胶质细胞密度的图像（图1）和碘化丙啶染色图像（图5）使用20×物镜以0.75×光学变焦分辨率获取：845 × 845 px。用于分析棘密度和棘体积的图像（图9）使用63×油浸物镜以1.3×光学变焦分辨率获取：1057 × 1057 px，Δz = 0.55 μm，在理想尼奎斯特速率下。用于获取Iba1染色的HexB-tdTom培养物图像（图11）的图像使用20×物镜以2.0×光学变焦分辨率获取：845 × 845 px。用于获取Iba1染色的急性皮层切片图像（图16）的图像使用70×油浸物镜以2.0×光学变焦分辨率获取：1057 × 1057 px，Δz = 1 μm。激光强度和检测器增益设置为在所有实验组之间实现可比较的整体荧光强度。

**活细胞成像**

在Zeiss LSM700显微镜上进行组织培养物的活细胞成像，该显微镜配备有10×水浸物镜（NA 0.6；Carl Zeiss）和70×水浸物镜（NA 1.0；Carl Zeiss）。将含有5-9个培养物的滤膜置于60 mm培养皿中，该培养皿含有预氧化的成像溶液，该溶液由80%（v/v）MEM、25%（v/v）基础培养基Eagle、10 mM HEPES缓冲液、0.15%（w/v）葡萄糖、0.15%（w/v）碳酸氢钠、1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素、5 mM谷氨酰胺和1 mM trolox组成。在成像过程中将培养物保持在37°C。

对来自HexB-tdTom转基因动物的纯合HexBtdT/tdT和杂合HexBtdT/+培养物进行活细胞成像，以评估rTMS后小胶质细胞形态（图11）。如上述rTMS和假刺激后立即开始成像，在连续氧合（5% CO₂/95% O₂）的成像溶液中进行。在6小时内，每5分钟记录同一细胞的z-stack，使用70×水浸物镜，Δz = 1 μm，在理想尼奎斯特速率下，光学变焦为1.3×，分辨率845 × 845 px，5×线平均。激光强度和检测器增益最初设置并在整个图像采集时间内保持恒定。

对C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP)培养物进行活细胞成像，以监测rTMS后TNFα表达作为神经炎症的指标（图12）。如上述rTMS和假刺激后，将培养物保持在培养箱中。6小时后，使用10×水浸物镜记录每个培养物的z-stack，Δz = 9.6 μm，在理想尼奎斯特速率下，光学变焦为0.8×，分辨率1057 × 1057 px。激光强度和检测器增益最初设置以在整个实验中保持荧光信号在动态范围内，并保持恒定。

共聚焦图像堆栈存储为.czi文件。

**转录组微阵列**

将在一个滤膜上培养的6个组织培养物转移至RLT缓冲液（QIAGEN）中作为一个样品，并根据制造商说明使用RNeasy Plus Micro Kit（#74034；QIAGEN）分离RNA。将RNA洗脱在30 μl水中，在0.18 M醋酸铵和10 μg甘氨酸（#R5884；Thermo Scientific）中通过添加128 μl 100%乙醇沉淀。样品在-80°C下孵育过夜，然后在4°C下以15000 rpm离心30分钟。沉淀用70%乙醇洗涤，再次离心并干燥。最后，将沉淀溶解在水中进行进一步处理。RNA浓度和完整性随后使用Fragment Analyzer（Advanced Analytical Technologies, Inc., USA）通过毛细管电泳分析。RNA质量数（RQN）≥ 7.0的RNA样品使用Affymetrix WT Plus Kit进一步处理，并与Clariom S小鼠阵列杂交，如制造商所述（Thermo Fisher, Germany）。简而言之，标记的片段在45°C下与阵列杂交17小时，转速为60 rpm，在GeneChip®杂交烘箱（Thermo Fisher, Germany）。洗涤和染色后，使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G（Thermo Fisher, Germany）扫描阵列。使用Affymetrix GeneChip Command Console软件版本4.1.5（Thermo Fisher, Germany）从原始数据生成CEL文件。

**细胞因子检测测定**

为了分析rTMS后的蛋白质释放，将培养物在界面配置中在孵育培养基中刺激，三个培养物在一个滤膜上生长。为了测试刺激期间的活性依赖性细胞因子释放，在一些实验中，在刺激期间将电压门控钠通道抑制剂河豚毒素（TTX，2 μM；Biotrend #15990-29-9）加入孵育培养基中。刺激3小时后，收集用于检测蛋白质释放的孵育培养基和用于基因表达分析的组织培养物，并在液氮中冷冻直至进一步处理。

对于细胞因子检测，使用了V-Plex促炎面板1小鼠试剂盒（#K15048D；Meso Scale Discovery）。将收集的孵育培养基在试剂盒提供的稀释剂中稀释1:1。根据制造商说明进行蛋白质检测。将预包被有捕获抗体的板与稀释的样品在4°C下孵育过夜。洗涤后，将样品在4°C下与含有电化学发光MSD SULFO-TAG检测抗体的溶液（Meso Scale Discovery）孵育过夜；抗体：抗小鼠TNFα抗体（#DRR4W）、抗小鼠IL-6抗体（#DRR4X）、抗小鼠CCL1抗体（#DRR4T）。洗涤后，使用MESO QuickPlex SQ 120仪器（Meso Scale Discovery）测量样品。使用MSD DISCOVERY WORKBENCH软件（Meso Scale Discovery）确定各自的蛋白质浓度。

**RNA分离和定量逆转录PCR（RT-qPCR）**

用于RT-qPCR分析的RNA分离如下进行。将在一个滤膜上培养的6个组织培养物转移至RNA Protection Buffer（New England Biolabs）中作为一个样品，并根据制造商说明使用Monarch®总RNA MiniPrep Kit（#T2015S；New England Biolabs）分离RNA。作为质量控制，使用Agilent RNA 6000 Pico Kit（#5067-1513；Agilent）通过2100 Bioanalyzer（#G2939BA；Agilent）测定分离的RNA的RNA完整性数（RIN）值；平均RIN值：7.6。纯化的RNA随后使用RevertAid RT Kit（#K1691；Thermo Scientific）逆转录。将cDNA稀释至水中终浓度为6 ng/μl。使用C1000 Touch Thermal Cycler（BIO-RAD）和CFX96实时PCR系统（BIO-RAD）进行RT-qPCR。将16.8 ng靶cDNA稀释在TaqMan基因表达预混液（#4369016；Applied Biosystems）中，使用标准TaqMan基因表达测定（Applied Biosystems；测定ID：Gapdh, Mm99999915_g1；Tnf, Mm00443258_m1；Il6, Mm00446190_m1；Cxcl1, Mm04207460_m1）。RT-qPCR方案如下进行：1个循环，50°C，2分钟；1个循环，95°C，10分钟；40个循环，95°C，15秒，60°C，1分钟。每个样品使用三个技术重复，在非模板对照中未检测到扩增。如果效率值小于90%或超过110%，根据BIO-RAD CFX Maestro软件包的自动化计算，则排除扩增曲线。数据导出并存储在计算机上，为.pcrf文件。

**全细胞膜片钳记录**

在37°C下对每个培养物中的6-9个神经元进行全细胞膜片钳记录。移液管溶液含有（mM）：140 K-葡萄糖酸盐、10 HEPES、3 KCl、1.5 Mg-ATP、0.6 GTP-Na₂、10肌酸磷酸、0.6%（w/v）生物胞素，pH 7.4，用KOH调节，渗透压用蔗糖调节至290 mOsm，尖端电阻为7-9 MΩ。锥体神经元使用配备有红外微分干涉对比和70×水浸物镜（NA 0.95；Olympus）的LN-Scope（Luigs & Neumann）进行视觉识别。电生理信号使用MultiClamp 700B放大器放大，使用Digidata 1440A数字化仪数字化，并使用pClamp 11软件包可视化。

对于组织培养物中CA1锥体神经元的全细胞膜片钳记录，浴液含有（mM）：150 NaCl、3 KCl、25 NaHCO₃、1.5 NaH₂PO₄、2 CaCl₂、2 MgCl₂和10葡萄糖（ACSF），并连续用5% CO₂/95% O₂氧合。在电压钳模式下，在-70 mV的保持电位下记录CA1锥体神经元的自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）。在每次记录前后监测系列电阻，如果系列电阻达到≥20 MΩ，则丢弃记录。对于CA1锥体神经元的mEPSC记录，将D-AP5（50 μM；Abcam #ab120003）、荷包牡丹碱（10 μM；Abcam #ab120106）和TTX（0.5 μM；Biotrend #15990-29-9）加入外部溶液中。

对急性小鼠脑片第2/5层皮层锥体神经元进行全细胞膜片钳记录，在含有保持ACSF的浴液中进行。对于sEPSC记录，在电压钳模式下将第2/5层锥体神经元保持在-70 mV。

对于在电流钳模式下记录内在细胞特性，将移液管电容校正为1.0 pF，并使用MultiClamp命令器的自动桥接工具补偿系列电阻。通过注入1秒方波电流脉冲从-100 pA开始，以10 pA的步长增加（扫描持续时间：5秒）生成I-V曲线。监测系列电阻，如果系列电阻达到≥20 MΩ，则丢弃记录。

**多尺度建模**

使用有限元方法和程序Gmsh（7.1.7）创建了一个具有两个隔室（即浴液和类器官组织培养物）的二维网格模型。局部网格分辨率从0.01增加到0.007单位，在培养物的CA1区域，即感兴趣区域（ROI），其中放置了神经元。最终网格由6,888 × 10³个节点和5,444 × 10⁴个四面体组成。四面体边缘的平均长度为8.9 μm，在ROI中。网格模型的物理尺寸根据体外设置进行调整。

将线圈到培养物的距离保持在10 mm，并将线圈定位在培养物上方。浴液和培养物的电导率分别为1.487 S/m和0.568 S/m。线圈电流的变化率设置为1.7 A/μs，在90% MSO下，并缩放至80% MSO。使用SimNIBS（6.1.7）和Matlab（2020b）进行宏观电场模拟。在所有模拟中使用了一个经过验证的30 mm MagStim八字形线圈。

对于多尺度建模，我们使用了Neuron Modeling for TMS（NeMo-TMS）框架来研究CA1锥体神经元对双相单脉冲TMS和rTMS的生物学响应（Shirinpour et al., 2021）。轴突形态从示例细胞中提取（Shirinpour et al., 2021）。对于所有神经元，我们实现了Jarsky模型的广义版本（Shirinpour et al., 2021）。

我们从树突和体细胞区室提取了膜电位和电压门控钙"内流"（Shirinpour et al., 2021）。我们分析了动作电位、钙尖峰及其峰值值。模拟在德国巴登-符腾堡州高性能计算（HPC）的计算机上运行。

**实验设计和统计分析**

**研究设计**

在本研究中，我们使用了年龄匹配的类器官延髓-海马组织培养物和8周龄成年小鼠，雌雄不限，采用前瞻性设计。用PLX5628处理用于从类器官组织培养物中耗竭小胶质细胞。仅用载体处理的年龄匹配培养物在这些实验中用作对照组。对于8周龄成年小鼠的体内小胶质细胞耗竭，使用BLZ945处理。未处理和仅用载体处理的相同年龄的小鼠在这些实验中用作对照组。在年龄匹配的组织培养物或8周龄成年小鼠中评估了对锥体神经元的兴奋性输入，然后进行重复磁刺激。假刺激的年龄匹配组织培养物或8周龄小鼠用作对照组。在包括用TTX、TNFα或IL-6处理的实验中，仅用载体处理用作对照组。

# 翻译

## 方法

### 微胶质细胞密度和树突棘密度的分析

为了分析微胶质细胞密度和树突棘密度，在共聚焦图像堆栈的最大强度投影中，使用Fiji图像处理软件（ImageJ）的"Cell Counter"插件（版本2.32；Schindelin等，2012）对细胞或树突棘进行手动计数。

树突棘体积使用共聚焦图像堆栈，通过Imaris x64版本9.8.0软件的表面工具结合"分割接触对象"选项进行测量。文件以.lims格式保存。

PI染色培养物的共聚焦图像使用Fiji图像处理软件进行处理和分析。经过背景减去（滚动球半径80 px）后，图像进行二值化处理，并使用"分析粒子"函数显示和计数PI阳性粒子。数值归一化为对照组的平均值。

C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP)转基因培养物的共聚焦图像堆栈按照前述方法（Lenz等，2020）使用Fiji图像处理软件进行处理和分析。培养区域的平均荧光强度归一化为假刺激培养物的荧光强度平均值。

树突形态学使用NeuroLucida 64软件（版本2023.1.4）进行评估。细胞使用"用户引导树突重建"功能进行半自动重建。重建结果保存为.DAT文件，分析在NeuroLucida Explorer（版本2019.1.4）中进行。

为了分析HexB-tdTom培养物中的微胶质细胞形态学，共聚焦图像堆栈使用Fiji图像处理软件进行处理和分析。对每个z-堆栈生成最大强度投影，并使用"可训练Weka分割"插件（Aranda-Carreteras等，2021）进行二值化处理。将同一微胶质细胞分类器应用于整个记录期间（6小时）的所有图像。去除离群值（半径>5 px）后，阈值设为80，手动评估每个图像的微胶质细胞扫描密度和微胶质细胞区域，如前所述（Pfeiffer等，2019）。数值归一化为平均值。

为了分析急性小鼠皮质切片中的微胶质细胞形态学，单细胞堆栈也使用Fiji图像处理软件进行处理和分析。首先，每个堆栈使用"去斑"函数进行处理，然后生成最大强度投影。去除离群值（半径>6 px）后，阈值设为80，如前所述对图像进行二值化处理。再次去除离群值（半径>5 px），阈值设为80，手动评估每个图像的微胶质细胞扫描密度和微胶质细胞区域。

单细胞记录使用Clampfit 10.7软件（Molecular Devices）离线分析。sEPSC和mEPSC性质使用自动化模板搜索工具进行事件检测（Lenz等，2021）。输入电阻通过注入-100 pA电流在200 ms时间帧内计算，最大距离至Sag电流。静息膜电位计算为基线平均值。AP检测使用输入-输出曲线阈值搜索事件检测工具，AP频率根据相应注射步骤期间检测到的AP数量进行评估。

微胶质细胞缺失的BL/6J-74处理假刺激组中的7个细胞由于记录I-V曲线期间贴片完整性丧失而被排除在内在特性分析之外（图16）。在对照组中，仅汇集载体处理和未处理动物的数据（图16）。

### Affymetrix GeneChip®微阵列数据

CEL文件使用Affymetrix转录组分析控制台（TAC）版本4.0.1.48进行分析。当FDR p值<0.05且倍数变化<-2或>2时，基因表达被认为显著不同。差异表达且注释良好的基因被认为是"微胶质细胞特异性"（图4），如果它们是Chiu等（Chiu等，2013）发现的高度特异性微胶质细胞标记物的一部分；如果这些基因在微胶质细胞中的表达在文献中有其他报道，则被认为是"微胶质细胞相关"。差异表达基因（包括预测基因）的完整列表见扩展数据表1-1。

RT-qPCR数据如前所述（Lenz等，2020）使用Bio-Rad CFX Maestro 1.0软件包进行分析，采用ΔΔCt方法，以Gapdh作为参考基因。数值归一化为相应载体处理对照组的平均值。

### 中尺度细胞因子检测分析

中尺度检测分析使用MSD DISCOVERY WORKBENCH 7.0平台进行分析。mRNA-蛋白水平相关性通过线性回归拟合进行评估，并使用非参数Spearman相关系数ρ进行分析。

### 多尺度建模的统计评估

多尺度建模的统计评估在R 4.3.6（https://www.r-project.org/）和R Studio 1.4.1366（https://www.rstudio.com/）集成开发环境中实施。我们运行了广义线性混合模型（GLMM），预测因子TREATMENT有两个水平：对照、PLX3394，以及COMPARTMENT有三个水平：胞体、顶端和基底树突。GLMM允许对不同分布的因变量进行建模，并同时建模固定和随机效应（Stroup, 2015）。零模型包含细胞作为随机截距，我们逐一添加每个预测因子及其交互项到后续模型中。贝叶斯信息准则（BIC）用于将当前模型与前一模型进行比较。如果ΔBIC至少比零模型或前一模型低10个单位，则选择获胜模型（Kass和Raftery, 1988；Anderson和Burnham, 2007；Fabozzi, 2017）。

### 数据分析

数据使用GraphPad Prism 8和9（GraphPad软件，美国）进行分析。由于无法假设数据的正态分布，因此使用非参数检验进行统计比较。对于列统计，使用Mann-Whitney检验比较两组，使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn's多重比较来比较三组。对于XY图的统计比较，使用重复测量双向ANOVA检验结合Sidak's多重比较。p值<0.05被认为具有显著差异。在文本和图表中，数值代表平均值±标准误（s.e.m.）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，无显著差异用"ns"表示。样本量在图例中提供。XY图中的统计差异在图例或图面板标题中指示（当通过多重比较检测到时）。

### 数据和材料可用性

包含统计评估的源数据已在Dryad数据仓库中提供（doi:10.5061/dryad.ngf4vhkzn）。原始数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

### 数字插图

插图使用Photoshop图形软件（Adobe，San Jose，CA，美国）制作。调整了图像亮度和对比度。

## 结果

### 药理学微胶质细胞缺失在器官型组织培养中

为了确定微胶质细胞在rTMS诱导突触可塑性中的作用，用集落刺激因子1受体（CSF-1R）拮抗剂PLX3394处理器官型组织培养物，该拮抗剂可有效清除微胶质细胞（Elmore等, 2017；Coleman等, 2020）。包含内嗅皮层和海马的培养物在体外暴露于10 μM PLX3394至少14天，从组织培养制备后立即开始（图1）。在3周龄培养物中观察到微胶质细胞的稳健且几乎完全清除（约97%细胞密度减少），如微胶质细胞标记物Iba1免疫染色所示（图1B-D，Mann-Whitney检验，p<0.001，n=8）。

微胶质细胞缺失的成功也通过RNA微阵列分析得到确认（图1E-G）。我们观察到PLX3394处理组中微胶质细胞特异性和微胶质细胞相关基因的表达显著降低（图1E，F）。具体而言，表征M0、M1和M2类微胶质细胞的基因集（Jurga等, 2020）在我们的培养物中减少（图1G）。相反，微胶质细胞缺失后，与星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元相关的基因（即突触基因）表达未发生重大变化。这些发现表明，用PLX3394处理可在3周龄器官型组织培养物中实现微胶质细胞的稳健且特异性清除。

### 微胶质细胞缺失组织培养物中的CA1锥体神经元不表达rTMS诱导的突触可塑性

微胶质细胞缺失的培养物和非缺失对照培养物使用10 Hz刺激方案进行刺激，该方案由800个脉冲组成，在80%最大刺激器输出下使用MagStim Rapid2刺激器配备AirFilm®线圈（图5）。在所有实验中，线圈与刺激组织在电场中的距离和方向保持恒定（图5A，B）。CA1锥体神经元被全细胞膜片钳，并在刺激后5-7分钟记录α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体介导的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）（图5C）。

假刺激对照组除刺激外以相同方式处理。与先前工作一致（Vlachos等, 2015；Lenz等, 2018；Lenz等, 2020），10 Hz rTMS在对照组织培养物的CA1锥体神经元中诱导了兴奋性突触的显著增强，如mEPSC平均振幅、半宽、面积和频率增加所示（图6A-C，Mann-Whitney检验：mEPSC振幅，p<0.001，n=1084；mEPSC半宽，p<0.001，n=889；mEPSC面积，p<0.001，n=981；mEPSC频率，p<0.001，n=1075；振幅-频率图：重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较，p刺激<0.001，F=14.16；p mEPSC振幅bin<0.001，F=146.1）。

相反，在微胶质细胞缺失的培养物中，rTMS后未观察到mEPSCs的变化（图6D-E，Mann-Whitney检验：mEPSC振幅，p=0.175，n=1487；mEPSC半宽，p=0.146，n=1706；mEPSC面积，p=0.954，n=1945；mEPSC频率，p=0.039，n=1695；振幅-频率图：重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较，p刺激=0.188，F=0.60；p mEPSC振幅bin<0.001，F=13.94）。这些结果表明，微胶质细胞的存在是rTMS诱导突触可塑性所必需的。

### 微胶质细胞缺失不影响细胞活力

微胶质细胞的神经营养和神经保护作用在该领域已得到广泛认可（例如，Jin等, 2017；Freitas等, 2020）。尽管在我们的实验中未观察到明显的细胞死亡迹象，且基线mEPSC性质在两组之间具有可比性（参见图6C和F），但我们决定谨慎行事，测试细胞活力的改变作为rTMS诱导突触可塑性的潜在混杂因素。在这些实验中，碘化丙啶（PI）染色用于评估我们制备物中的活力和细胞死亡（参见Lenz等, 2020）。PI是一种膜不通透性荧光分子，可与DNA结合。因此，当应用于活组织时，PI可用为膜完整性的标记物。

用PLX3394 10 μM处理的培养物或仅载体对照用PI染色，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）处理的培养物（10 μM，7小时）在这些实验中作为阳性对照（图7A，Kruskal-Wallis检验结合Dunn's事后校正：对照-PLX，p=0.94；对照-NMDA，p<0.001）。PI信号在3周龄对照培养物和年龄匹配的PLX3394处理制备物中相对较低，而在NMDA处理组中检测到PI信号显著增加（图7A）。我们从这些结果得出结论，CA1锥体神经元无法表达rTMS诱导的突触可塑性并非基于微胶质细胞缺失后细胞活力的改变或细胞死亡。

### 微胶质细胞缺失组织培养物中CA1锥体神经元无重大功能和结构变化

神经元的兴奋性和形态学预计对电磁刺激的结果产生重大影响（Aberra等, 2020；Shirinpour等, 2021）。因此，我们测试了微胶质细胞缺失对我们实验中CA1锥体神经元结构和功能特性的影响（图7-9）。另一组CA1锥体神经元在对照和微胶质细胞缺失组织培养物中记录，并进行死后形态学分析（图7B；参见图8和9）。

PLX3394介导的微胶质细胞缺失不影响CA1锥体神经元的基本功能特性，即静息膜电位（图7C，Mann-Whitney检验，p=0.039，n=699）和输入电阻（图7D，Mann-Whitney检验，p=0.186，n=778）。在高电流注入下，动作电位频率在两组之间观察到轻微但非显著差异（图7E，重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较，p处理=0.145，F=5.77；p电流注入<0.001，F=147.16）。同样，AMPA受体介导的自发性EPSC（sEPSC）的振幅和频率在组间无显著差异（图7F，Mann-Whitney检验：sEPSC振幅，p=0.666，n=757；sEPSC频率，p=0.730，n=766）。这些结果表明，微胶质细胞缺失不影响CA1锥体神经元的基本功能特性和突触活性。

与这些发现一致，Sholl分析显示顶端和基底树突未受微胶质细胞缺失对CA1锥体神经元树突形态学的主要影响（图7A，B，重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较：顶端树突，p处理=0.930，F=0.05；p半径<0.001，F=77.188；基底树突，p处理=0.149，F=1.64；p半径<0.001，F=146.15）。我们未观察到总树突长度（图7C，Mann-Whitney检验，p=0.175，n=148）、分支点数量（图7D，Mann-Whitney检验，p=0.166，n=150.18）或末端数量（图7E，Mann-Whitney检验，p=0.184，n=163）的显著差异。

最后，CA1树突棘的详细形态学分析证实了我们的sEPSC记录结果，显示两组之间树突棘密度和棘头体积无显著差异（图9A，Mann-Whitney检验：树突棘密度，p=0.937，n=94；树突棘头体积，p=0.149，n=1030.09；放射状层（rad）的放射层（ori），图9B，Mann-Whitney检验：树突棘密度，p=0.039，n=94；树突棘头体积，p=0.189，n=128.744；腔隙分子层（lac-mol），图9C，Mann-Whitney检验：树突棘密度，p=0.039，n=600；树突棘头体积，p=0.164，n=154.244）。

综上所述，我们得出结论，微胶质细胞缺失不会导致CA1锥体神经元发生重大结构和功能变化，这些变化可以轻易解释神经元在微胶质细胞缺失时无法表达rTMS诱导的突触可塑性。

### 现实多尺度计算机模型预测rTMS诱导的去极化和细胞内Ca²⁺水平无重大差异

我们进一步使用多尺度计算方法评估了10 Hz rTMS对CA1锥体神经元的影响，将rTMS的物理输入参数与树突形态学和亚细胞神经效应联系起来（图6；Shirinpour等, 2021）。从微胶质细胞缺失和非缺失组织培养物中记录的CA1锥体神经元重建的3D形态学模型用于这些实验（图6A）。在该建模方法中评估了膜电压和钙浓度（图6B-F）。我们估计了CA1锥体神经元的突触权重恰好在放电阈值以下的最小值。与我们的实验数据一致，模型中微胶质细胞缺失和非缺失组织培养物的CA1锥体神经元的突触权重没有差异（图6G）。

我们比较了膜电压的峰值。获胜模型（ΔBIC=674.157，F5,405=1466.188，p=5.15×10⁻⁴⁹）使用区室作为预测因子。证实我们的预期，分析显示顶端树突（p=-77.1857，p=5.15×10⁻⁴⁹）和基底树突（p=-9.1896，p=5.16×10⁻⁴⁰）中的峰值值显著较弱。然而，处理对任何区室中的峰值动作电位值均无影响（图6H）。

我们继续比较从区室和处理条件中提取的峰值钙浓度值。对于电压数据，获胜模型（ΔBIC=166.6568，F5,405=556.184，p=5.15×10⁻⁴⁹）使用区室作为预测因子。同样，分析显示顶端树突（p=-24.197，p=5.15×10⁻⁴⁹）和基底树突（p=-4.168，p=5.15×10⁻⁴⁹）中的峰值值显著较弱。然而，处理对任何区室中的峰值钙浓度水平均无主要影响（图6I）。

### 重复性磁刺激不影响微胶质细胞的结构特性

在证明CA1锥体神经元的结构和功能差异不能解释我们的主要发现，即在微胶质细胞缺失时神经元无法表达rTMS诱导的突触可塑性之后，我们考虑了rTMS对微胶质细胞结构和功能特性的可能影响（图8-10）。

为了测试10 Hz rTMS对微胶质细胞形态学和动力学的影响，从表达红色荧光蛋白串联二聚体tdTomato（在六糖胺酶B（HexB）启动子控制下）的HexB-tdTom小鼠制备培养物（Masuda等, 2020）。培养物的免疫染色确认，约97%的tdTomato阳性细胞也表达Iba1，且在97%的所有Iba1阳性细胞中检测到tdTomato信号（图8A）。显然，在从HexB-tdTom小鼠制备的3周龄组织培养物中，绝大多数微胶质细胞可通过tdTomato容易地识别。

活细胞显微镜用于对微胶质细胞成像，即在CA1放射层中表达tdTomato的细胞（图8B-E）。共聚焦图像堆栈每5分钟获取一次，持续6小时，在10 Hz rTMS或假刺激后立即开始（图8B）。在这些实验中，我们未观察到rTMS相关的微胶质细胞形态学主要变化。微胶质细胞动力学在最大强度投影中的详细分析（图8B-D）揭示了rTMS刺激和假刺激组织培养物之间微胶质细胞动态域和扫描密度的无显著变化（图8E，重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较：微胶质细胞域，p刺激=0.167，F=1.0；p时间<0.001，F=7.168；扫描密度，p刺激=0.05，未检测到多重比较中的显著差异，F=9.156；p时间<0.001，F=9.156）。我们得出结论，10 Hz rTMS不会导致微胶质细胞形态学和动力学的重大变化。

我们进一步排除了在从转基因TNFα报告小鼠系制备的组织培养物中rTMS诱导的微胶质细胞病理性激活，该小鼠系在TNFα启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（图10A；C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP)）。在我们先前的研究中，我们发现了微胶质细胞的强烈病理性激活，即EGFP表达的显著增加，在存在细菌脂多糖的情况下（Lenz等, 2020）。在这里，活细胞显微镜显示10 Hz rTMS后EGFP荧光无明显变化（图10B，Mann-Whitney检验，p=0.94，n=677）。我们得出结论，10 Hz rTMS不会在器官型组织培养物中引起炎症反应。

### 重复性磁刺激触发活性依赖性释放可塑性促进细胞因子

微胶质细胞在生理条件下（即在没有微胶质细胞形态学和炎症的主要变化时）分泌的细胞因子的可塑性调节作用已得到充分确立（Tancrède等, 2000；Stellwagen和Malenka, 2006；Santello等, 2011；Cao等, 2017；Habbas等, 2018；Maggio和Vlachos, 2018；Chai等, 2018；Heir和Stellwagen, 2020；Lenz等, 2020）。具体而言，TNFα和IL-6与神经元表达突触可塑性的能力有关（Tancrède等, 2000；Stellwagen和Malenka, 2006；Rizzo等, 2018）。在此背景下，我们最近能够证明低浓度的TNFα促进神经元表达突触可塑性的能力（Maggio和Vlachos, 2018）。因此，我们假设10 Hz rTMS可以触发TNFα和其他细胞因子的活性依赖性产生和/或分泌，其浓度可促进可塑性。

我们在10 Hz刺激和假刺激的微胶质细胞缺失和非缺失组织培养物中进行了RT-PCR分析和蛋白检测分析（图10）。事实上，10 Hz rTMS触发了TNFα（图10A）、IL-6（图10B）和CCL4（图10C）的增加，这些在微胶质细胞缺失的组织培养物中不存在（详细统计见表10-1）。蛋白水平与mRNA水平之间的正相关性对于TNFα（图10D）、IL-6（图10E）和CCL4（图10F）在非缺失组织培养物中是明显的（详细统计见扩展数据表10-2）。

为了测试rTMS诱导的微胶质细胞细胞因子释放是否具有活性依赖性，在一组不同的非缺失组织培养物中，我们在刺激期间用1 μM TTX阻断电压门控钠通道（图11）。事实上，在这些实验中，TNFα（图11A）、IL-6（图11B）和CCL4（图11C）在mRNA和蛋白水平上均无显著变化（Kruskal-Wallis检验，详细统计见扩展数据表11-1）。这些结果表明，10 Hz rTMS诱导微胶质细胞细胞因子的活性依赖性释放。

### 在刺激期间替代可塑性促进细胞因子可挽救微胶质细胞缺失组织培养物中的rTMS诱导突触可塑性

然后我们测试了外源性替代TNFα和IL-6是否能挽救CA1锥体神经元在微胶质细胞缺失时表达rTMS诱导突触可塑性的能力（图12）。在刺激期间仅向培养基中添加TNFα（8 ng/ml）和IL-6（1.8 ng/ml），并从刺激后5-7分钟开始记录微胶质细胞缺失组织培养物中CA1锥体神经元的AMPA受体介导的mEPSCs（图12A）。

事实上，在这些实验中，rTMS诱导了突触增强，即mEPSC平均振幅显著增加（图12B，Kruskal-Wallis检验，假-rTMS：p=0.164，假-rTMS+细胞因子：p=0.036）和半宽（图12C，Kruskal-Wallis检验，假-rTMS：p=0.165，假-rTMS+细胞因子：p=0.036），而mEPSC面积（图12D，Kruskal-Willis检验，假-rTMS：p=0.169，假-rTMS+细胞因子：p=0.168）和mEPSC频率（图12E，Kruskal-Wallis检验，假-rTMS：p=0.144，假-rTMS+细胞因子：p=0.145）保持不变。

值得注意的是，在假刺激条件下，将微胶质细胞缺失培养物暴露于相同浓度的TNFα和IL-6并未影响mEPSC振幅与假刺激微胶质细胞缺失培养物（未暴露于TNFα和IL-6）相比（n=20细胞，n假-细胞因子=52细胞；mEPSC振幅：57.15±0.186 pA 假刺激 vs. 57.16±0.176 pA 假刺激-细胞因子，ns；mEPSC频率：0.134±0.039 Hz 假刺激 vs. 0.138±0.028 Hz 假刺激-细胞因子，p<0.05；Mann-Whitney检验）。我们得出结论，rTMS期间微胶质细胞释放的TNFα和IL-6是rTMS诱导突触增强所必需的。

### 体内微胶质细胞缺失防止rTMS诱导小鼠mPFC中的兴奋性突触可塑性

最后，我们测试了微胶质细胞的存在是否对体内rTMS诱导的突触可塑性是必需的（Thimm和Funk, 2018；Lenz等, 2019；Klostermann和Funk, 2020）。如前所述（Lenz等, 2019），通过连续5天每日应用CSF-1R抑制剂BLZ945（120 mg/kg，口服灌胃）实现体内微胶质细胞缺失（Hagemeyer等, 2017；Masuda等, 2020）。麻醉的微胶质细胞缺失和非缺失小鼠使用与我们的体外实验相同的10 Hz刺激方案进行刺激（参见Lenz等, 2019）。刺激后2小时，制备包含内侧前额叶皮层（mPFC）的额脑切片，并从mPFC的浅层锥体神经元记录AMPA受体介导的sEPSCs（图13A）。

BLZ945诱导的微胶质细胞缺失通过额脑切片的Iba1染色得到确认（约90%细胞密度减少，在BLZ945处理的动物中；图13B，Mann-Whitney检验，p<0.05，n=8）。虽然体内微胶质细胞缺失对基线突触传递无显著影响，但在非缺失动物中观察到的sEPSC频率显著增加在微胶质细胞缺失动物中不存在。值得注意的是，sEPSC平均振幅在微胶质细胞缺失和非缺失动物中保持不变（图13C，Mann-Whitney检验：sEPSC振幅，p对照=0.168，n对照=96.8；pBL/6J=0.94，nBL/6J=1557；sEPSC频率，p对照<0.001，n对照=70.58；pBL/6J=0.175，nBL/6J=1430）。振幅-频率图证实rTMS促进了振幅依赖性sEPSC频率增加，该增加在微胶质细胞缺失动物的mPFC中不存在（如果未逆转的话）（图13C，D，重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较：对照，p刺激<0.001，F=14.166；p sEPSC振幅bin<0.001，F=55.164；BL/6J，p刺激=0.155，F=1.185；p sEPSC振幅bin<0.001，F=88.165）。

尽管在非缺失动物中rTMS后输入电阻有轻微但显著的降低，但这些变化发生在被动（图13E，Mann-Whitney检验：静息膜电位，p对照=0.158，n对照=96.67；pBL/6J=0.189，nBL/6J=1377；输入电阻，p对照=0.037，n对照=88.69；pBL/6J=0.189，nBL/6J=1376）和主动（图13F，重复测量双向ANOVA结合Sidak's多重比较：对照，p刺激=0.145，F=5.77；p电流注入<0.001，F=88.166；BL/6J，p刺激=0.197，p<0.05；p电流注入<0.001，F=54.15）膜特性无重大变化的情况下，在微胶质细胞缺失和非缺失动物中。

与我们在海马CA1区域的体外实验类似，在麻醉小鼠的mPFC中未观察到rTMS诱导的微胶质细胞形态学变化（图13G，H，Mann-Whitney检验：扫描密度，p=0.143，n扫描密度=695；微胶质细胞域，p=0.94，n微胶质细胞域=753）。这些结果证明了微胶质细胞在rTMS诱导的体内突触可塑性中不可或缺的、即可塑性促进的作用。

## 讨论

本研究的实验证明，微胶质细胞的存在是10 Hz rTMS在脑组织中诱导突触可塑性所必需的，无论是在体外还是在体内。在此背景下，微胶质细胞的功能激活被观察到，反映在活性依赖性基因表达和细胞因子释放上，而微胶质细胞形态学和动力学保持不受影响。事实上，TNFα和IL-6的替代挽救了微胶质细胞缺失的脑组织培养物中神经元表达突触可塑性的能力。这些结果表明，rTMS有效地调节微胶质细胞功能，即细胞因子释放，在刺激的脑区域中，从而确定了一种新的作用机制，这可能解释rTMS在健康个体和患者中的一些有益效果。

有人提出，rTMS诱导的后效应由"类LTP"可塑性机制介导（Ziemann, 2007）。该证据基于人体受试者中获得的系统水平研究的生理特征和药理学类比（Korchounov和Ziemann, 2014；Ziemann等, 2018；Brown等, 2020）以及从动物模型获得的数据（Hoogendam等, 2010；Vlachos等, 2015）。具体而言，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的药理学调节的作用被解释为"类LTP"可塑性的证据，考虑到NMDA受体在LTP诱导中的相关性（Vlachos等, 2015；Lenz等, 2018；Brown等, 2020）。我们自己的先前工作证明，网络活动的药理学抑制、NMDA受体或L型电压门控钙通道的阻断阻止了神经元表达由10 Hz rTMS诱导的突触可塑性（Vlachos等, 2015；Lenz等, 2018）。与这些发现一致，在无Ca²⁺外部溶液中刺激未能诱导突触可塑性，从而确认了Ca²⁺依赖性信号通路在rTMS诱导突触可塑性中的相关性（Lenz等, 2018）。值得注意的是，NMDA受体和L型电压门控钙通道也在微胶质细胞上表达（Murugan等, 2014；Hoppe, 2020）。事实上，大量实验证据表明，细胞内Ca²⁺水平的调节调节重要的微胶质细胞功能（Laprell等, 2020）。因此，从动物模型和人类研究中获得的一些结果可以解释为——至少部分——通过神经元和微胶质细胞中钙信号通路的调节。

在此建议的背景下，本研究提供了10 Hz rTMS时活性依赖性表达和释放可塑性促进细胞因子的证据。用TTX对钠通道的药理学抑制阻断了细胞因子的产生和释放。此外，微胶质细胞缺失对rTMS诱导突触可塑性的有害影响在刺激期间用活性依赖性细胞因子TNFα和IL-6替代时得到挽救。需要进一步的研究来确定rTMS是直接作用于微胶质细胞，还是微胶质细胞是否通过感知rTMS诱导的神经元活动变化（例如通过微胶质细胞谷氨酸受体、嘌呤能受体或其他信号通路）而被间接调节（Cserep等, 2020）。

尽管有这些考虑，本研究表明，微胶质细胞的存在是rTMS诱导突触可塑性所必需的：微胶质细胞缺失的组织培养物中的CA1锥体神经元以及成年小鼠mPFC中的浅层锥体神经元未表达rTMS诱导的兴奋性突触可塑性。这些发现支持了最近强调的胶质细胞对非侵入性脑刺激的神经效应的影响。

经颅磁刺激（TMS）对皮层第五层锥体神经元的影响 Gellner等人，2024年。有趣的是，我们在小胶质细胞缺失的组织培养物中未观察到任何明显的功能性或结构性改变迹象。与这些发现一致的是，多尺度区室建模证实，神经元的基本形态学和功能特性并不能解释第五层锥体神经元无法表达TMS诱导的突触可塑性。然而，我们必须承认，由于难以可靠地可视化和重建单个神经元的完整轴突形态，因此未获得详细的轴突形态学重建结果。事实上，计算研究强调了轴突和髓鞘化在TMS诱导的突触可塑性中的重要性（Fields, 2008; Wang et al., 2017; Aberra et al., 2020; Shirinpour et al., 2024）。尽管我们未在实验设置中观察到网络活动的任何差异——因为小胶质细胞缺失的组织培养物的sEPSC幅度或频率均未受影响——但与这些发现一致的是，我们的RNA微阵列分析未显示树突棘计数的差异，也未发现少突胶质细胞标志物发生改变。因此，考虑到我们在仅于刺激期间短期暴露于TNF-α和IL-6即可恢复TMS诱导的突触可塑性的拯救实验，第五层锥体神经元的结构和功能特性发生重大变化不太可能解释我们的结果。然而，值得注意的是，10 Hz TMS在小胶质细胞缺失的培养物中并未完全挽救至非缺失刺激培养物的水平。虽然难以确定TNF-α和IL-6在突触部位的精确浓度，但很可能存在额外的小胶质细胞机制（例如通过小胶质细胞与突触之间的物理接触所介导的信号）共同参与了TMS诱导的突触可塑性。

既往研究表明，促炎性细胞因子影响兴奋性神经传递（Stellwagen和Malenka, 2009; Cao et al., 2017; Strehl et al., 2017; Riazi et al., 2018; Maggio和Vlachos, 2017; Shepard et al., 2019）。具体而言，TNF-α和IL-6被证实是重要的分泌因子，可调节突触传递（Furukawa和Mattson, 1998; Stellwagen et al., 2008; Garcia-Oscos et al., 2015）以及突触可塑性（Heir和Stellwagen, 2020）。在此背景下，已有研究表明TNF-α作为许可因子发挥作用（Steinmetz和Turrigiano, 2010; Becker et al., 2016），其本身并不触发突触强度的显著变化，而是调节神经元表达可塑性的能力，而不影响基础突触传递——除了突触前谷氨酸释放的变化（Santero et al., 2014），这也反映在我们实验中观察到的mEPSC频率增加上，其中小胶质细胞缺失的组织培养物在无电磁刺激条件下暴露于TNF-α和IL-6。事实上，采用经典强直电刺激实验表明，低浓度TNF-α可快速促进LTP诱导，而高浓度TNF-α则阻碍神经元表达LTP的能力，同时不影响基础突触传递（Maggio和Vlachos, 2017）。这些结果与TNF-α的元塑性效应一致。与此病理机制相关的是，小胶质细胞被细菌脂多糖激活后强烈诱导TNF-α产生（即TNF-α mRNA增加10–44倍，蛋白水平增加约2000倍），从而阻碍第五层锥体神经元表达10 Hz TMS诱导的突触可塑性（Lenz et al., 2023）。结合本研究结果，这些发现表明小胶质细胞在TMS诱导的突触可塑性中发挥重要作用。这呼吁对TMS诱导的小胶质细胞可塑性进行系统评估，并提出了TMS可能通过激活小胶质细胞来招募元可塑性的有趣可能性。因此，TMS在患者中观察到的部分有益效应可能至少部分归因于其对小胶质细胞功能的影响，而小胶质细胞似乎也参与促进神经元在刺激后短时间内表达“类LTP”可塑性的能力。

致谢：我们感谢Simone Zenker提供的技术支持，以及弗莱堡大学医学院下一代测序核心设施（NGS-CF）在转录组分析方面的协助。作者还感谢巴登-符腾堡州通过高性能计算资源（bwHPC; bwUniCluster 2.0）提供的支持。

资助：本研究由弗莱堡大学医学院MOTIVATE研究生院资助（给AE）、弗莱堡大学医学院EQUIS医学科学家计划（给ML）、弗莱堡大学医学院（TUR2024/26给Z7）以及德国研究基金会（DFG）项目ID 54663057-BTRR 175给AV。

作者贡献：作者贡献按CRediT分类法分配。AE：验证、形式分析、调查、撰写初稿、可视化、资金获取。DG：调查。Z7：调查、形式分析。MF：调查。MK：调查。DP：资源。TM：资源。MP：资源。ML：概念化、方法学、验证、形式分析、调查、撰写初稿、可视化、监督、项目管理、资金获取。AV：概念化、方法学、资源、撰写初稿、监督、项目管理、资金获取。

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图1：PLX3397在器官型组织培养物中清除小胶质细胞 A：用DAPI核染色（EC，内皮皮层；DG，齿状回）标记的器官型组织培养物。比例尺，200 μm。 B、C：用Iba1（小胶质细胞标志物）染色的代表性组织培养物。注意对照组培养物中小胶质细胞的均匀分布及PLX3397处理后小胶质细胞的清除（7天，18天）。比例尺，200 μm。 D：各组小胶质细胞计数（对照组：n=17培养物；PLX3397组：n=18培养物；Mann-Whitney检验，U=0.1，p<0.05）。

E-G：对照培养物和PLX3397处理的培养物的Affymetrix微阵列分析。E：火山图显示倍数变化和FDR p值。显著上调转录本以绿色表示，显著下调转录本以红色表示。F：差异表达转录本的分类。85.7%的差异表达转录本为小胶质细胞特异性或与小胶质细胞相关（详见扩展数据表1-4）。G：差异表达基因集的层次聚类，特征为M0、M1和M2分类的小胶质细胞。每组样本由6个合并培养物组成（n=6样本/组）。

个体数据点以彩色点表示。值表示均值±SEM（p<0.001）。

图2：10 Hz重复磁刺激在器官型组织培养物中 A-B：用DAPI核染色的器官型组织培养物（B）由直径为30 mm的外翼线圈（Magstim Company, UK）刺激。过滤器插件携带5-9个组织培养物，置于Petri皿下方线圈内。电磁场方向和距离线圈在所有实验中保持一致（DAPI核染色）。比例尺，200 μm。 C：假刺激培养物未受刺激但其他处理相同。刺激后，培养物在培养箱中保持2-7小时，随后进行膜片钳记录等实验程序。

图3：小胶质细胞缺失的组织培养物中第五层锥体神经元不表达由10 Hz重复磁刺激（rTMS）诱导的兴奋性突触可塑性 A：在组织培养物中记录并事后染色的第五层锥体神经元示例，用Iba1（小胶质细胞标志物）染色。比例尺，100 μm。 B、C：样本痕迹和组数据，显示从假刺激和10 Hz rTMS刺激培养物（2-7小时后）记录的第五层锥体神经元中AMPA受体介导的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）（对照组：n=85细胞；rTMS组：n=90细胞；Mann-Whitney检验，幅度：p=0.1048，半宽度：p=0.1075，面积：p=0.889，频率：p=0.984；RM双因素ANOVA followed by Sidak’s multiple comparisons test for amplitude-frequency-plot）。 D：在PLX3397处理、小胶质细胞缺失的组织培养物中记录并事后染色的第五层锥体神经元示例，用Iba1（小胶质细胞标志物）染色。比例尺，100 μm。 E、F：样本痕迹和组数据，显示从假刺激和10 Hz rTMS刺激的小胶质细胞缺失组织培养物（2-7小时后）记录的第五层锥体细胞中AMPA受体介导的mEPSCs（PLX3397-假刺激组：n=94细胞；PLX3397-rTMS组：n=88细胞；Mann-Whitney检验；RM双因素ANOVA followed by Sidak’s multiple comparisons test for amplitude-frequency-plot）。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（p<0.001，ns，无显著差异）。p<0.01，p<0.05。

图4：小胶质细胞缺失不影响细胞活力和第五层锥体神经元的基本功能特性 A：用碘化丙啶染色的组织培养物（左：载体对照；中：PLX3397 7天，18天；右：NMDA 7天，18小时）。量化碘化丙啶信号的组数据（右图）（对照组：n=57培养物；PLX3397 7天：n=55培养物；NMDA：n=19培养物；Kruskal-Wallis检验 followed by Dunn’s post-hoc correction）。比例尺，200 μm。 B：示例性膜片钳记录和事后鉴定的第五层锥体神经元。比例尺，100 μm。 C、D：第五层锥体神经元在小胶质细胞缺失（即PLX3397 7天，18天处理）和对照组培养物中的被动膜特性组数据（对照组：n=66细胞；PLX3397：n=60细胞；Mann-Whitney检验）。 E：第五层锥体神经元在相应组中的动作电位频率组数据（对照组：n=66细胞；PLX3397：n=60细胞；RM双因素ANOVA followed by Sidak’s multiple comparisons）。 F：从第五层锥体神经元记录的AMPA受体介导的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）组数据，显示小胶质细胞缺失组织培养物中兴奋性神经传递无显著变化（对照组：n=66细胞；PLX3397：n=60细胞；Mann-Whitney检验）。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（p<0.001，ns，无显著差异）。p<0.05。

图5：小胶质细胞缺失组织培养物中第五层锥体神经元的树突形态不受影响 A：三维重建的第五层锥体神经元在非缺失对照和PLX3397处理（即小胶质细胞缺失）组织培养物中的示例。比例尺，100 μm。 B：从重建的第五层锥体神经元在相应组中分析顶端和基底树突的Sholl分析（对照组：n=50细胞；PLX3397：n=18细胞；RM双因素ANOVA followed by Sidak’s multiple comparisons）。 C-E：同一组重建的第五层锥体神经元在小胶质细胞缺失组织培养物和载体处理的对照培养物中的额外形态学参数组数据（对照组：n=50细胞；PLX3397：n=18细胞；Mann-Whitney检验）。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（ns，无显著差异）。

图6：小胶质细胞缺失组织培养物中第五层锥体神经元的树突棘未发生改变 A-C：示例性树突段和组数据，显示从PLX3397处理（即小胶质细胞缺失）组织培养物和对照组培养物中膜片钳记录和事后鉴定的第五层锥体神经元在放射状放射（rad）、放射状定向（sor）和放射状腔隙分子层（clm）中的棘密度和棘体积（rad密度：对照组：n=19树突段，PLX3397：n=15树突段；rad体积：对照组：n=853 spines，PLX3397：n=676 spines；sor密度：对照组：n=18树突段，PLX3397：n=19树突段；sor体积：对照组：n=703 spines，PLX3397：n=606 spines；clm密度：对照组：n=69树突段，PLX3397：n=56树突段；clm体积：对照组：n=988 spines，PLX3397：n=708 spines；Mann-Whitney检验）。比例尺，6 μm。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（ns，无显著差异）。

图7：重复磁刺激（rTMS）的多尺度计算机建模 A：在代表性组织培养物环境中，从重建的第五层锥体神经元建模的rTMS神经元反应。EC，内皮皮层；DG，齿状回。比例尺，200 μm。 B、C：在恒定刺激强度下，对10 Hz的20个脉冲序列评估膜电压（Vm，B）和细胞内钙水平（Ca2+，C）的变化。第五层锥体神经元在两种条件下均表现出延迟的超阈值反应。 D：刺激后细胞突触权重和突触权重未显示第五层锥体神经元在小胶质细胞缺失和非缺失对照培养物之间的显著差异（载体处理：n=50细胞；PLX3397：n=18细胞；广义线性混合模型）。 E：在同一组细胞中，对磁刺激的峰值膜电压差异在躯体、顶端和基底树突区室中建模。两组之间未观察到差异。 F：分析刺激触发的细胞内钙水平变化。在小胶质细胞缺失组织培养物和对照培养物之间，第五层锥体神经元的树突和躯体区室均未发现变化。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（ns，无显著差异）。

图8：重复磁刺激（rTMS）不影响小胶质细胞形态 A：从同源HexBtdT/tdT小鼠制备的Iba1染色组织培养物的代表性图像。注意串联二聚体tdTomato表达的小胶质细胞。右图：组数据显示两个信号几乎完全重叠（Iba1+：n=546细胞在8培养物中；tdTomato+：n=547细胞在8培养物中）。比例尺，80 μm。 B-D：在10 Hz rTMS后以5分钟间隔从HexBtdT/tdT培养物成像的tdTomato表达小胶质细胞在海马区域CA1中的示例。显示最大强度投影（B）、小胶质细胞扫描密度（C）和小胶质细胞域（D）。比例尺，14 μm。 E：从rTMS刺激和假刺激组织培养物中获得的小胶质细胞域和扫描密度的组数据（假刺激：n=9细胞，rTMS：n=9细胞来自每组9培养物；RM双因素ANOVA followed by Sidak’s multiple comparisons）。

值表示均值±SEM（ns，无显著差异）。

图9：重复磁刺激（rTMS）不诱导神经炎症样本图像（A）和组数据（B）显示从TNF-α报告小鼠（C57BL/6-Tg(TNFa-eGFP)）制备的rTMS刺激和假刺激组织培养物中eGFP荧光强度（DG，齿状回；假刺激：n=59培养物，rTMS：n=50培养物；Mann-Whitney检验）。比例尺，200 μm。

个体数据点以灰色点表示。值表示均值±SEM（ns，无显著差异）。

图13：重复性磁刺激（rMS）触发促可塑性微胶质细胞因子的表达与释放（1457–1469）。

A–C：左图：在非耗竭培养基和微胶质细胞耗竭（PLX5622处理）培养物中，rMS（10 Hz）及假刺激对照条件下，肿瘤坏死因子α（TNF-α）（A）、白细胞介素-6（IL-6）（B）和趋化因子配体1（CCL1）（C）的mRNA水平。每组n = 3个培养物；右图：在相应实验条件下，培养上清液中TNF-α（A）、IL-6（B）和CCL1（C）的蛋白水平。每组n = 3个培养物。采用Mann-Whitney检验；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著差异。详细统计评估见扩展数据表10-1。

D–F：在非耗竭对照培养物（左图）和微胶质细胞耗竭（PLX5622处理，右图）培养物中，TNF-α（D）、IL-6（E）和CCL1（F）的mRNA水平与蛋白水平之间的相关性。每组n = 3个培养物。详细统计评估见扩展数据表10-2。

灰色点表示个体数据点。数值以均值 ± 标准误（s.e.m.）表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著差异。（1479）

图14：活性依赖性微胶质细胞因子释放（1480–1485）。

A–C：右图：在非耗竭培养物中，假刺激、TTX（2 μM）及rMS（10 Hz）条件下，TNF-α（A）、IL-6（B）和CCL1（C）的mRNA水平和蛋白水平。每组n = 3个培养物。采用Kruskal-Wallis检验后接Dunn事后校正；详细统计评估见扩展数据表14-1。

灰色点表示个体数据点。数值以均值 ± 标准误（s.e.m.）表示；ns，无显著差异。（1488）

图15：在微胶质细胞耗竭的组织培养中，促炎细胞因子的替代在刺激过程中挽救rMS诱导的突触可塑性（1490–1495）。

A：实验设计示意图。部分组织培养物在存在TNF-α（8 ng/ml）和IL-6（1.8 ng/ml）的条件下进行刺激；假刺激培养物中TNF-α和IL-6的影响已在正文中报告。（1496–1503）

B–E：在假刺激和rMS（10 Hz）刺激的培养物中，AMP受体介导的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的组数据（假刺激：n = 81个细胞；rMS：n = 67个细胞；rMS + TNF-α/IL-6：n = 79个细胞）。采用Kruskal-Wallis检验后接Dunn事后校正。

灰色点表示个体数据点。数值以均值 ± 标准误（s.e.m.）表示；*P < 0.05；ns，无显著差异。（1509–1512）

图16：体内微胶质细胞耗竭可预防r706诱导的成年小鼠内侧前额叶皮层浅层锥体神经元的突触可塑性（1513–1526）。

A：通过链霉亲和素染色对非耗竭（左图）和微胶质细胞耗竭（BLZ945处理，右图）成年小鼠内侧前额叶皮层（mPFC）浅层锥体神经元进行离体可视化。微胶质细胞通过Iba1免疫标记显示。标尺：100 μm。（1527–1530）

B：定量分析显示，BLZ945处理动物mPFC中微胶质细胞数量显著减少（对照组：n = 10只动物；BLZ945处理：n = 8只动物）。采用Mann-Whitney检验；***P < 0.001。（1531–1534）

C：在非耗竭和微胶质细胞耗竭小鼠中，r706（10 Hz）及假刺激后6–8小时，mPFC第2/3层锥体神经元中AMP受体介导的自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）的组数据（非耗竭对照组：n = 157个细胞来自8只动物；非耗竭r706组：n = 144个细胞来自8只动物）。采用Mann-Whitney检验；sEPSC频率：非耗竭组P = 0.02657。（1535–1538）

D：各组sEPSC记录的振幅-频率图。采用双向ANOVA后接Sidak多重比较检验。（1541–1544）

E–F：在非耗竭和微胶质细胞耗竭小鼠中，r706（10 Hz）及假刺激后6–8小时，mPFC第2/3层锥体神经元的被动和主动膜特性组数据（对照组-假刺激：n = 157个细胞；对照组-r706：n = 144个细胞；BLZ945-假刺激：n = 77个细胞；BLZ945-r706：n = 84个细胞）。采用Mann-Whitney检验及双向ANOVA后接Sidak多重比较检验进行动作电位频率分析；对照组输入电阻P = 0.048696。一个数据点（BLZ945-假刺激输入电阻 = 746.15 MΩ）超出y轴范围。（1545–1550）

G–H：代表性图像及组数据显示，在非耗竭小鼠中，r706（10 Hz）及假刺激后6–8小时，mPFC中Iba1阳性微胶质细胞数量（假刺激：n = 64个细胞来自8只动物；r706：n = 64个细胞来自8只动物）。采用Mann-Whitney检验。标尺：100 μm。（1553–1556）

灰色点表示个体数据点。数值以均值 ± 标准误（s.e.m.）表示；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；ns，无显著差异。（1559）

扩展数据图例（1560–1567）

表1-1：微胶质细胞相关或特异性基因的差异表达微阵列分析。（1568–1571）

表10-1：mRNA（RT-qPCR）和蛋白检测（MSD assay）结果的统计评估。（1572–1575）

表10-2：细胞因子检测实验中mRNA与蛋白水平的线性回归分析。（1576–1579）

表14-1：在TTX存在下重复性磁刺激的细胞因子检测实验的统计评估。（1580）